污染物对无脊椎动物乙酰胆碱酯酶活性的影响研究进展

刘文秀

摘要 从无脊椎动物的角度，综述了乙酰胆碱酯酶的特性及其在国内外的研究进展，并对该领域研究前景进行了展望，旨在为环境监测、农药残留及疾病治疗等方面提供科学依据。

关键词 无脊椎动物；乙酰胆碱酯酶；污染物

中图分类号 S859.82 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）02-0004-04

Abstract We summarized the characteristics of acetylcholinesterase and its research progress at home and abroad from the perspective of invertebrates. The research foreground of this field was prospected， so as to provide scientific basis for environmental monitoring， pesticide residue，disease treatment and so on.

Key words Invertebrates；Acetylcholinesterase；Contaminants

随着工农业生产的发展，各种废水大量排放，再加上化学农药的不合理使用，使得环境污染问题日益严重，对生态环境及人类安全造成一定影响，引起了世界各国的普遍关注。大多数无脊椎动物个体小，生活自由，容易受环境影响，适宜研究生态毒理作用，并被作为潜在环境污染的筛选工具[1]。其中，枝角类作为指示生物检测400多种化学物的毒性[2]。

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是生物神经传导中的一种关键性酶，在胆碱能突触间，该酶能降解乙酰胆碱（ACh），终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。大多数污染物是AChE的抑制剂，进入环境后，影响生物机体AChE的活性，造成大量动物的死亡。为了避免这种现象的发生，国内外学者就不同污染物对动物AChE的毒理学机制进行了研究。笔者从无脊椎动物的角度，综述了AChE的特性以及作为神经传导的标志物在该领域的研究进展，旨在为生态环境监测、农药残留及疾病治疗等提供科学依据。

1 乙酰胆碱酯酶的性质

1.1 蛋白质结构和基因结构

从蛋白结构来看，AChE最突出的特征就是有一个深而窄的狭口，活性基团位于此狭口中，而活性中心主要由以下3个部分组成（图1）：①酯解部位，主要由丝氨酸和组氨酸组成，可以与乙酰胆碱的羧基碳原子结合；②季铵基团结合部位，ACh含季铵阳离子部分，与AChE活性中心上的阴离子部位结合；③疏水性区域，该区域有色氨酸或酪氨酸等芳香族氨基酸，与酯解或季铵基团结合部位连接或在其附近，在与芳香族底物结合中起重要作用[3]。

从基因结构来看，自1986年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的第1个AChE基因被克隆以来，生物体内的AChE催化亚基的cDNA逐步被发现，这些cDNA均编码1个长度535个氨基酸左右的多肽链。绝大部分生物的AChE由单个Ace基因编码，但线虫基因组中有4种Ace基因（Ace-1、Ace-2、Ace-3、Ace-4），棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）、冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）和三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）4种昆虫中发现2种Ace基因（Ace-1、Ace-2）[5]。不同生物间Ace的碱基长度、内含子、外显子数目不同，结构就不同，所以它们编码的AChE对抑制剂的敏感性也不同。

根据NCBI数据库中得到不同物种AChE的基因序列，利用MEGA 5.1软件构建了系统发育树（图2），显示了不同物种间AChE基因的亲缘关系：大型溞Daphnia magna（AB697764.1）、玻璃海鞘Ciona intestinalis（NM_001128877.1）、

斑马鱼Danio rerio（NM_131846.2）、家蝇Musca domestica（AF533335.1）、鲤鱼Cyprinus carpio（AB361595.1）、河鲀Tetraodon nigroviridis（AY733039.1）、橄榄星室木虱Pseudophacopteron canarium（DQ425058.1）、根结线虫Meloidogyne javanica（AF080184.1）、马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata（GU066339.1）、

巴氏白蛉Phlebotomus papatasi（JQ922267.1）、药材甲Stegobium paniceum（GU944767.1）、盲鳗Myxine glutinosa（U55003.1）、催命按蚊Anopheles funestus（JN815138.1）、厩螫蝇Stomoxys calcitrans（HM125963.1）、

拟黑多刺蚁Polyrhachis vicina（JF742990.1）、螺旋蝇Cochliomyia hominivorax（FJ830868.1）、埃及血吸虫Schistosoma haematobium（AY228511.1）、南方根瘤線虫Meloidogyne incognita（AF075718.1）、烟草甲Lasioderma serricorne（GU211888.1）、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis（FN538987.1）、褐飞虱Nilaparvata lugens（FM866396.2）。结果发现，家蝇、厩螫蝇和螺旋蝇三者间的亲缘关系较近，根结线虫和南方根瘤线虫的AChE基因也比较相似，而按蚊与其他物种的AChE基因的亲缘关系相对较远。这些物种间AChE基因亲缘关系的远近可能就是由于其编码基因的不同所造成的。

1.2 乙酰胆碱酯酶的生物学功能

AChE是生物体内反应速度最快的酶之一（Kcat=1.6×104 s-1），是丝氨酸水解酶最重要的家族成员之一，在脊椎动物和无脊椎动物体内都有分布，是生物神经传导中的一种关键性的酶，调节ACh转换，负责终止跨突触的许多神经元细胞信息的传递。AChE是一种多分子型的复杂蛋白质，在中枢及外周神经系统与ACh受体一起完成神经之间动作电位的传递，从而保证神经信号在生物体内的正常传递[6]。

在生态毒理学中，AChE被认为是神经系统中胆碱能信号传导的最重要的生物标志物，因此AChE活性检测被广泛应用于研究中，酶抑制是化学诱导的神经毒性的征兆[7]。在环境监测中，无脊椎动物的AChE常被作为指示剂，监测环境中污染物的含量。AChE可能与细胞的发育和成熟有关，此外，有研究发现利用不同方式诱导细胞凋亡，均检测到AChE的表达，且AChE的反义核酸可以部分抑制细胞凋亡，说明AChE对细胞凋亡有一定的影响[8]。医学研究发现，AChE促进释放ACh时，致使迷走神经兴奋，表现为心率减慢、血管扩张、消化道平滑肌收缩、消化腺分泌增加等，从而引起胃肠蠕动。杨筱珍等[9]研究发现，通过肠道铺片和组化染色的方法发现在中华绒螯蟹后肠中广泛存在AChE，促进肠道的排泄，肠胃蠕动加剧，使机体摄食率增加。

1.3 乙酰胆碱酯酶的分布情况

在不同无脊椎动物体内，AChE的含量和组织分布均存在差异。研究发现，AChE主要合成于肝脏，存在于肌肉、肝胰、心脏、肠黏膜、血浆及神经组织（如脑白质、神经细胞髓鞘）等，其中在脑组织中的AChE含量最高[3]。在组织中，也主要存在于胆碱能神经末梢突触间隙，特别是运动神经终板突触后膜的褶皱中聚集较多。

2 国内外对乙酰胆碱酯酶的研究进展

2.1 污染物对生物体内乙酰胆碱酯酶活性的影响 1953年，Stedman等首先从马血清中分离出AChE后，不同生物体内的AChE相继得到分离和研究，对AChE的研究也更加广泛。

工业上，不同形式的金属废物排入环境中，在生物体内富集，尤其在低等的无脊椎动物体内，直接影响机体AChE的活性，对动物的生长发育造成一定伤害。李会等[10]研究发现暴露在 60 mg/L Fe3+溶液中，泥鳅脑组织中AChE活性显著降低（P<0.05），表明 Fe3+对泥鳅具有神经毒性。暴露于毒死蜱（CHP）和Cu后，紫贻贝鳃中AChE的活性也显著降低[11]。然而，暴露在纳米颗粒TiO2中的扇贝组织鳃和消化腺内的AChE活性都随时间的增长呈上升趋势，表现出时间-剂量效应关系[12]。纳米形式的金属对机体AChE的影响都不是特别明显，只有达到一定时间和剂量才会起作用。暴露在ZnO纳米颗粒下的蜜蜂，脑组织中AChE的活性基本不受影响[13]。据此推测，可能是金属的纳米形式比离子形式的毒性小，对AChE的抑制作用也较弱。

除了金属物质外，各种药物排入环境中，对AChE也会产生一定的影响。张丹等[14]研究发现在亚致死浓度（LC5、LC10和LC20）胁迫下，氧化乐果、甲萘威和辛硫磷对摇蚊幼虫AChE活性都有明显的抑制作用。熏蒸剂对谷物象鼻虫的AChE也有显著的抑制作用[15]。相同地，暴露在反式肉桂醛下，果蝇AChE活性表现出显著的抑制作用[16]。以上污染物都对无脊椎动物机体AChE表现出抑制作用，然而可能由于化学药物的不同特性，对AChE会有不同的作用。溴化1-乙基-3-甲基咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈抑制趋势，LC50浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势；溴化1-丁基-3-甲基咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势，在LC50浓度处理下呈抑制趋势；1，2-二甲基咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在LC20浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势；在LC50浓度处理下呈先诱导后抑制的趋势，3种离子液体在斜纹夜蛾体内的积累对体内AChE的活性均有不同程度影响，改变生物体内神经信号的传导，导致生物体严重的行为改变、功能紊乱、瘫痪，从而产生毒害作用[17]。Deng等[18]研究发现低浓度的毒死蜱短期对小菜蛾体内AChE的活性增加23.5%～29.8%。同时暴露在杀虫剂氯虫苯甲酰胺和真菌病原体的东亚飞蝗体内AChE活性在后期也呈上升趋势[19]。

随着对AChE研究的不断扩展延伸， AChE的应用已经深入到医药或疾病治疗等领域。医学研究发现，AChE不仅参与胆碱能神经递质的传遞，而且具有调节和促进神经组织的发育和神经再生的神经营养因子样作用。Prugh等[20]研究表明暴露于有机磷的间充质干细胞（MSC）的AChE活性降低， 造成MSC分化成成骨细胞的能力降低。大量医学研究表明，目前用于阿尔茨海默病（AD）的治疗主要基于AChE抑制剂的给药[21]，且已经在临床上得到实践。

2.2 乙酰胆碱酯酶活性改变的机理

基于目前国内外对AChE的广泛研究，污染物对生物体AChE的毒性研究越来越受到关注，尤其各种农药对无脊椎动物毒性反应的影响已经成为焦点[22-23]。当污染物进入机体与AChE相互作用时，与AChE活性中心的丝氨酸发生不可逆反应，产生一个更稳定的污染物-乙酰胆碱酯酶络合物，使AChE不能有效水解ACh，在体内大量积累，受体不断被激活，突触后神经纤维长期处于兴奋状态，引起战栗、痉挛[24]。然而，过量的ACh又可以造成去极化阻断，从而抑制了神经传导，使机体后期逐渐失去活动能力，昏迷死亡。

不同污染物对AChE的影响程度还取决于污染物和酶的化学特性。AChE有多个不同的结合部位，不同污染物对它们的结合能力不同，影响作用也不同。Dos Santos Miron等[24]研究发现污染物诱导AChE活力上升，推测可能是由于机体在应对外源污染物时的一种应激机制，通过加快AChE的合成来补偿污染物对机体产生的胁迫。AChE活力升高表明神经递质胆碱水解增强，引起烟碱和毒蕈碱受体活化下降，造成正常的神经信息传递也受到影响，导致实验动物中毒。AChE活性的下降，表明污染物浓度的升高，对机体的神经毒性增大，酶活力中心丝氨酸受到抑制，酶的结构发生改变，酶失活；也可能是因为大量的活性氧自由基抑制了酶的活力[25]。

2.3 污染物对水溞乙酰胆碱酯酶的影响

枝角类作为食物链中的关键物种，在食物链中起重要的作用。水溞营养价值高、繁殖快、适口性好，适合大量培养，是许多水产品动物的饵料，对多种有毒物质敏感，是毒性试验中普遍采用的标准试验材料。因此，枝角类的饵料价值和应用前景已引起国内外学者的广泛关注。通过对污染物胁迫无脊椎动物AChE机理的研究，分析污染物对水溞AChE活性的影响。

研究發现，对乙酰氨基酚（镇痛药）和双氯芬酸（抗炎药）的摄入显著抑制了大型溞的AChE活性，说明对乙酰氨基酚和双氯芬酸具有干扰大型溞神经传递的能力[26]。Toumi等[27]研究表明将大型溞暴露在氰菊酯和拟除虫菊酯杀虫剂下，AChE活性均显著降低。大型溞在AgNPS下胁迫48 h，随着AgNPS浓度的升高，AChE活性升高，与Ulm等[28]的研究结果一致。

通过对水溞AChE的研究，发现不同污染物对水溞AChE有不同程度的影响，这可能与污染物的化学特性有关，不同污染物与机体酶的结合能力不同，而且对AChE的效应时间和剂量也不同。

3 小结与展望

AChE是生物神经传导中的一种关键性的酶。低等无脊椎动物在污染物的胁迫下，AChE可作为一种生物指示剂来监测环境的污染情况。大量研究表明，大多数无脊椎动物在污染物的胁迫下，AChE活性随着污染物浓度的升高会呈现下降趋势，使得动物机体神经中毒，甚至导致死亡。

水溞作为一种甲壳类水生动物，在水环境系统食物链中起着关键作用。当机体受到污染物胁迫时，水溞AChE能迅速发生变化，为监测水质污染、保护生态环境和防治污染物提供科学依据，同时也可为今后研究工作的开展奠定理论基础并提供技术支撑。

随着分子技术、基因工程和计算机模拟技术等的发展，这些成果被广泛应用到水环境污染监测、农药残留检测、生态环境保护以及人类疾病治疗等领域。利用分子生物学技术，检测水体动物体内AChE的活性及其基因等一系列变化来反映水环境的污染情况。通过点突变技术和基因克隆技术获得对有机磷和氨基甲酸酯类化合物敏感的乙酰胆碱酯酶的cDNA序列，利用基因克隆使其在微生物中大量表达，提取大量敏感性的AChE，用于研制生物传感器，检测农产品或环境中的有机磷和氨基甲酸酯类农药的含量[29]。在疾病防治方面，某些疾病（如阿尔茨海默病、重症肌无力病等）的发生也与AChE有密切的关系。Zhang等[30]研究发现在动物细胞凋亡过程中会表达特异性带尾亲水型的AChE，这为肿瘤以及其他功能性疾病的检测提供了新思路。

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