海带多糖LJP61A对动脉粥样硬化的调控机制研究

陈浩然

摘要 [目的]探讨海带多糖LJP61A对动脉粥样硬化的调控作用。[方法]采用高脂饮食诱导LDLr-/-小鼠动脉粥样硬化模型，用海带多糖LJP61A进行灌胃，观察其对动脉粥样硬化的调控机制。[结果]LJP61A可以缓解动脉粥样硬化引起的血管斑块形成，并下调血管炎症。随着海带多糖添加量的增加，抗动脉粥样硬化作用增强。[结论]海带多糖LJP61A可以通过减轻血管炎症来发挥干预动脉粥样硬化形成机制。

关键词 海带多糖；动脉粥样硬化；调控机制

中图分类号 R543.5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0158-04

Abstract [Objective] To discuss the regulation mechanism of laminarin LJP61A on atherosclerosis. [Method] LDLr-/- mouse atherosclerosis model was induced by highfat diet. Mice was fed with Laminarin LJP61A by intragastric administration.The regulation mechanism of laminarin LJP61A on atherosclerosis was observed. [Result] LJP61A could relieve atherosclerotic plaque formation and reduce vascular inflammation. With the increase of laminarin dose， antiatherosclerosis strengthened.[Conclusion]LJP61A could play a role in the regulation mechanism of atherosclerosis by reducing blood vessel inflammation.

Key words Laminarin；Atherosclerosis；Regulation mechanism

動脉粥样硬化主要是由于机体脂质代谢发生障碍而引起的局部或全身性血管病变[1]。动脉粥样硬化形成的主要机制是由于大量炎症的诱导，此过程中多种免疫细胞参与其中[2]。

海带属于褐藻类植物，呈扁平带状，最长可达到20 m，因其多产及独特的口感已被广泛用作烹饪食材。研究表明，海带多糖LJP61A能够通过减缓主动脉血管钙化来干预肾衰竭的进程，并且海带多糖还具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等作用[3-11]。笔者探讨了海带多糖LJP61A缓解动脉粥样硬化的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

研究对象。新鲜海带头购自安徽省合肥市包河区家乐福超市； LDLr-/-小鼠由合肥工业大学动物实验中心提供。

1.1.2

主要试剂。ELISA试剂盒购自源叶生物公司；油红O染色液购自索莱宝公司；苏木素购自索莱宝公司；辛伐他汀购自杭州默沙东制药有限公司。

1.1.3

主要仪器。磁力搅拌器由德国IKA公司生产；紫外分光度计购自上海美浦达公司。

1.2 方法

1.2.1

海带多糖的提取。海带多糖（LJP61A）经过清洗晒干后磨粉，然后通过水提醇沉得到醇提物，经脱蛋白透析后得到粗多糖，再经DEAE和S500离子交换树脂过滤得到单一组分LJP61A[12-13]。

1.2.2 饲喂试验。将LDLr-/-雄性小鼠（7周龄）在SPF级动物房适应性喂养1周，将小鼠随机分为5个组别，每组16只，分别为正常对照组（普通低脂日粮，LFD）、模型组（高脂日粮，HFD）、低剂量海带多糖组[高脂日粮+LJP61A 50 mg/（kg·d）]、高剂量海带多糖组[高脂日粮+LJP61A 200 mg/（kg·d）]及阳性对照组[0.014 g/（kg·d）辛伐他汀，SIM]。正常对照组小鼠饲喂普通低脂日粮，购自安徽医科大学动物实验中心。高脂日粮配方参考文献[14]。连续喂养14周，每周测量各组小鼠的体重，14周后禁食过夜，用CO2处死。取一半肾脏置于PBS缓冲液中，于-4 ℃下保存；将另一半肾脏浸泡于4%多聚甲醛中。

1.2.3

血管的油红O染色。将主动脉根部的血管标本从4%的多聚甲醛固定液中取出，漂洗剥膜。取60 mL储备液，加入蒸馏水至100 mL，染色。最后用蒸馏水浸泡标本，将处理好的血管腔展开，并固定形态，使用Image-Pro Plus Version 6.0软件分析计算斑块面积。

1.2.4

主动脉弓HE染色。将主动脉弓的石蜡切片分别置于100%的二甲苯和二甲苯与乙醇（按1∶1混合）溶液中15 min脱蜡；脱蜡后的切片分别用100%乙醇溶液、95%乙醇溶液、75%乙醇溶液脱水1 min，再用95%乙醇溶液、100%乙醇脱水；松节油浸入后，烘干封片。

1.2.5

巨噬细胞CD68的免疫组化。利用二步法免疫组织化学检测系统，将石蜡包埋的切片置于60 ℃烘箱中烤片1 h，用二甲苯、酒精脱蜡后依次用自来水冲洗2 min，放入去离子水使用摇床振荡清洗，重复2次，用灭菌生理盐水（0.01 mol/L）持续冲洗5 min，重复3次。将切片放入室温下的0.01 mol/L柠檬酸盐修复液中置于微波炉80 ℃加热5 min，然后40 ℃低火持续15 min，取出室温下自然冷却，在摇床上使用PBS缓冲液清洗1次。加入3%的H2O2 去离子水室温孵育10 min消除内源性过氧化物酶，使用PBS缓冲液清洗3次后加入血清稀释的一抗CD68（37 ℃孵育2 h或4 ℃孵育过夜），取出后加入即用型Polymer Helper和即用型Polyperoxidase-anti-mouse IgG 20 min，并用PBS缓冲液冲洗3次后加入DAB显色液。

1.2.6

ELISA检测动脉粥样硬化血管中炎性因子的水平。按照ELISA试剂盒操作步骤测定TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.2.7

荧光定量PCR检测动脉粥样硬化血管中炎性因子mRNA的表达。精确称量小鼠血管组织100 mg，用灭菌消毒的手术剪在冰上充分均匀剪碎后，放入1 mL匀浆器中，各加入TRlzol 1 mL于冰上充分研磨，将组织匀浆液转入1.5 mL EP管中室温下静置5 min，放入低温高速离心机下（4 ℃，12 000 r/min）离心5 min，转移上清至新的EP管中，加入氯仿200 μL，连续振荡15 s，使其充分混匀，在室温下静置10 min。然后，放入低温高速离心机下（4 ℃，12 000 r/min）离心15 min，转移上清液至新的EP管中。加入异丙醇500 μL，轻轻摇晃管中液体，室温下静置10 min，管底出现乳白色胶状沉淀，即为RNA。最后，使用低温高速离心机（4 ℃，12 000 r/min）离心10 min，吸掉上清。各加入1 mL乙醇（75%）清洗沉淀物，轻轻摇晃漂洗，8 000 r/min离心5 min，保留沉淀并在室温下将EP管倒置于滤纸上晾干，分别加入DEPC 20 μL水使RNA溶解，充分振荡混匀。用移液枪吸取RNA溶液1 μL，使用Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter仪器测定RNA浓度及相对吸光度（A260/A280），以判定提取的RNA是否达标。最后，进行反转录和PCR扩增。定量PCR引物见表1。

1.3 数据统计与分析

试验数据使用SPSS统计软件进行处理。结果均以±SD表示，用方差分析进行显著性比较。*表示与正常对照组差异显著（P<0.05）；**表示与正常对照组差异极显著（P<0.01）；#表示与模型组差异显著（P<0.05）；##表示与模型组差异极显著（P<0.01）。

2 结果与分析

2.1 主动脉的油红O染色

各组小鼠主动脉的油红O染色结果如图1所示。从图2可以看出，与正常对照组相比，模型组动脉粥样硬化面积占总面积的比例极显著增加（P<0.01）。高剂量海带多糖组、低剂量海带多糖组与阳性对照组动脉粥样硬化面积占总面积的比例均显著低于模型组。随着海带多糖LJP61A添加量的增加，动脉粥样斑块的面积越小。

2.2 主动脉弓HE染色

从图3可以看出，模型组小鼠血管内壁有明显的脂块堆积，而低剂量海带多糖组和高剂量海带多糖组血管内壁脂块堆积程度明显降低。

2.3 巨噬细胞CD68的免疫组化染色

从图4可以看出，正常对照组小鼠主动脉中巨噬细胞的CD68表达稳定，而模型组巨噬细胞的CD68明显增多，低剂量海带多糖组和高剂量海带多糖组CD68阳性表达显著减少。

2.4 LJP61A对小鼠血管炎性因子含量的影响

从图5可以看出，模型组小鼠血管内的TNF-α、IL-1β和IL-6大量增加；低剂量海带多糖组和高剂量海带多糖组TNF-α、IL-1β、IL-6含量明显降低，且随着LJP61A添加量的增加，TNF-α、IL-1β和IL-6含量明显降低。这表明海带多糖LJP61A能夠显著抑制炎性因子的增加。

2.5 LJP61A对血管中炎性因子mRNA表达的影响

由图6可知，与模型组相比，海带多糖LJP61A干预组能明显下调TNF-α、IL-6的表达，且随着LJP61A添加量的增加，下调作用越明显。

3 讨论

临床研究表明，动脉粥样硬化的进展最终导致易损斑块的发展，这可能增加心血管事件的风险。血管壁中活性氧的增加或减少是动脉粥样硬化的主要原因。动脉粥样硬化易发区的血管滋养层密度较高，是动脉粥样硬化形成的早期事件，此外，编码VEGF的腺病毒的外膜递送引发新血管的生成和内膜增生，而血管生成抑制剂减弱斑块生长。在人体内，伴有出血的斑块内血管的生成主要与薄壁动脉粥样硬化，巨噬细胞浸润与大的坏死核心（即脆弱斑块）有关。斑块新生血管通常是渗漏的，因此可能会释放斑块内红血球（出血）。此外，动脉粥样硬化病变诱发的壁内出血与红细胞碎片增多、铁沉积、泡沫细胞和胆固醇晶体形成有关。

血管生成过程可以由缺氧诱导的表达和血管生成因子释放（例如VEGF）直至氧量正常恢复。在动脉粥样硬化斑块中，由于内膜增厚和炎症，动脉腔内的局部O2扩散可能不足。缺氧和炎症状态促进血管生成和炎症因子的释放，这些因子刺激从血管滋养血管发芽血管生成。这种新血管可以提供营养，并促进巨噬细胞浸润，血管壁增厚，脂质沉积，炎症和动脉粥样硬化病变进展。因此，动脉粥样硬化斑块小鼠具有较高的炎性细胞浸润。

平滑肌含量使纤维帽变薄和斑块内出血。另外，斑块肩区域在内膜平滑肌细胞和纤维帽胶原中有较高水平的钙蛋白酶-2、半胱天冬酶-3和基质金属蛋白酶-2。海带多糖LJP61A可能是抗炎相关和氧化应激相关动脉粥样硬化并发症的可行治疗策略。动脉粥样硬化是以大量胆固醇和非分解性炎症为特征的中大动脉血管壁的多灶性改变。动脉粥样硬化病变中的新血管形成在斑块生长和不稳定性中起主要作用。血管生成过程由经典血管生成因子和特异于动脉粥样硬化血管生成的其他因子介导。除了在斑块进展中的作用外，新血管形成可能参与斑块不稳定和血栓栓塞事件。在各种动物模型中，抗血管生成剂对于减轻动脉粥样硬化是有效的。动脉粥样硬化斑块的变化特征在于从病理内膜增厚进展到纤维粥样瘤薄帽纤维粥样瘤[15]，并最终到斑块破裂和血栓形成。这些斑块通常被描述为不稳定或易损斑块，其特征在于巨大的坏死核心和变薄的纤维帽，其被巨噬细胞和淋巴细胞浸润并且缺乏或少量平滑肌细胞。目前动脉粥样硬化斑块的病理生理学已被广泛研究[16-17]。然而，斑块进展的分子机制和斑块破裂的触发因素尚不确定。该研究结果表明，CD68表达增加了巨噬细胞的内皮下堆积，这在动脉粥样硬化进展期间在巨噬细胞浸润或增殖或自身抗体形成方面具有广阔的病理意义[18-19]，而海带多糖LJP61A能够通过降低炎性因子的表达和聚集来缓解血管动脉粥样硬化的形成。

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