响应面法优化龙竹竹叶黄酮的提取工艺及抗氧化研究

段丽娜 郭磊 刘超 夏文俊 张永鸿 邱碧丽

摘要 [目的]研究龙竹竹叶黄酮的提取工艺及抗氧化性。[方法]以乙醇为溶剂对龙竹竹叶黄酮（flavonoids from Dendrocalamus giganteus leaves，简称FDL）进行提取，优化了提取FDL的工艺参数，分析黄酮提取物的抗氧化性。[结果]通过响应面分析得出FDL提取工艺的最佳参数组合为：浸提温度74.2 ℃、乙醇浓度79.2%、料液比1.0 ∶36.5（g ∶mL）、浸提时间3.28 h。在此提取条件下，FDL提取率可达到721%。抗氧化研究表明，FDL对DPPH、O2 ·-和 ·OH都具有良好的清除作用。[结论]龙竹竹叶黄酮是一种可开发的食品抗氧化剂。

关键词 龙竹；黃酮；提取；响应面法；抗氧化

中图分类号 TS201.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0169-04

Optimization of Extraction Process and Antioxidant of Flavonoids from Dendrocalamus giganteus Leaves by Response Surface Method

DUAN Lina1，GUO Lei2，LIU Chao1 et al

（1.Baoshan Quality and Technical Supervision Comprehensive Testing Center， Baoshan， Yunnan 671000；2.School of Light Industry and Food Engineering， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan 650224）

Abstract [Objective] The research aimed to study the extraction process and antioxidation of flavonoids from Dendrocalamus giganteus leaves. [Method] Flavonoids in Dendrocalamus giganteus levels （FDL） was extracted by ethanol as solvent，the process parameters of FDL extraction were optimized and the antioxidant activity of flavonoid extracts was analyzed.[Result]The optimal parameters of the FDL extraction process were obtained by response surface analysis： extraction temperature 74.2 ℃， ethanol concentration 79.2%， solid-liquid ratio 1.0 ∶365， and extraction time 3.28 h.In the conditions， the extraction ratio of FDL was 7.21%. Antioxidant studies showed that FDL had a good scavenging effect on DPPH， O2 ·- and ·OH.[Conclusion] Flavonoids from Dendrocalamus giganteus leaves is a kind of food antioxidant which can be developed.

Key words Dendrocalamus giganteus；Flavonoids；Extraction；Response surface method；Antioxidant

作者简介 段丽娜（1982—），女，云南大理人，工程师，从事食品检测和分析研究。*通讯作者，讲师，硕士，从事食品资源开发及利用研究。

收稿日期 2018-05-21； 修回日期 2018-06-13

龙竹（Dendrocalamus giganteus Munro）材质好，笋味佳，繁殖容易，成林成材迅速，是云南省栽培面积最大、用途最广、经济价值最高的竹种[1]。龙竹主产于滇南、滇西南，生于海拔500～1 500 m的低山、坝区，滇西北怒江和澜沧江上游以及滇中金沙江河谷也有分布[2]。

近年来，人们围绕竹类主要化学成分的分析及其提取物开发利用开展了大量的研究工作。据报道，竹叶提取物的化学成分包括黄酮及其苷类、多糖类、特种氨基酸及其肽类、芳香成分以及锰、锌、硒等微量元素，其应用价值可与银杏相媲美[3]。研究表明，黄酮类化合物是优良的自由基清除剂和抗氧化剂，且清除能力的强弱取决于黄酮类化合物的类型和结构，也取决于它们的亲脂性和亲水性，且对人类营养、健康和老年性疾病的防治有重要意义[4]。

笔者利用响应面分析法（response surface methodology，RSM）优化FDL的提取工艺获得最佳的FDL提取工艺条件，并对FDL进行纯化来研究其体外抗氧化性能，为进一步提升龙竹竹叶的综合利用价值提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

龙竹竹叶（采自西南林业大学竹园）；芦丁标准品（C27H30O16，纯度99%）、无水乙醇、95%乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、石油醚、冰醋酸，以上药品均为分析纯。DPPH、羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基以及产生超氧阴离子自由基试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 试验仪器与设备

GZX-9240MBE电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）、MS205DU电子天平（梅特勒-托利多公司）、数显电子恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）、UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）、BCD-215ADL海尔冰箱（青岛海尔股份有限公司）、RE300旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、TDL-40B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）、液-液萃取装置、真空泵（上海鑫磊真空设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制[5-6]。

1.3.2 FDL提取的工艺流程。

龙竹竹叶→预处理→浸提→过滤→离心→萃取→浓缩→干燥→成品。

1.3.2.1 预处理。将所采竹叶清洗干净后于70 ℃烘箱内烘干，取出后用粉碎机充分粉碎，过60目筛，将所得竹叶粉装入棕色磨口瓶备用。

1.3.2.2 离心。将黄酮提取液移至离心管，于离心机中以4 000 r/min的速度离心10 min，以除去少量叶绿素和其他水不溶性杂质。

1.3.2.3 萃取。离心后取上清液加入等体积石油醚充分振荡，静置分层后分离收集下层液。反复萃取直到上层液为无色或微有颜色为止。收集提取液置棕色瓶中备用[7]。

1.3.3 单因素试验。

以FDL提取率为试验指标，研究提取时间（min）、提取温度（℃）、料液比（g ∶mL）、乙醇浓度（%）对FDL提取效果的影响。

1.3.4 响应面试验设计。

在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken试验设计四因素三水平的響应曲面分析方法，选择单因素试验中对响应值有显著影响的因素，如选取提取时间、提取温度、料液比、乙醇浓度为考察因素，以X1、X2、X3和X4表示，因素水平设计见表1。利用Design-Expert 8.0.6统计软件，通过逐步回归对试验数据进行回归拟合[8-10]

1.3.5 验证试验。

验证试验包含提取物验证和最佳工艺验证。

1.3.6 FDL对DPPH自由基清除能力的测定。

准确将FDL配成8种浓度（10、40、80、100、120、160、200、240 μg/mL）。取9支试管，取2 mL DPPH溶液及2 mL FDL溶液加入同一比色管中，同时取2 mL DPPH及2 mL无水乙醇作为标准对照管，将上述各管放置30 min后，并以VC为参照，在525 nm处测定吸光度。自由基清除能力计算公式：K=[1-（A3-A2）/A1]×100，式中，K为清除率；A1为2 mL无水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度，A2为2 mL FDL溶液加2 mL无水乙醇的吸光度，A3为2 mL FDL溶液与2 mL DPPH溶液反应后的吸光度。

1.3.7 FDL对超氧阴离子自由基清除能力的测定。

准确地将FDL配成8种浓度（60、80、100、120、140、180、210、240 μg/mL），并以VC为参照，清除率=[（对照管-测定管）/（对照管-标准管）]×100%。

1.3.8 FDL对羟自由基清除能力的测定。

准确地将FDL配成8种浓度（50、100、200、300、400、500、600、700 μg/mL），并以VC为参照，清除率=[（对照管-测定管）/（标准对照管-标准空白管）]×100%。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

以吸光度为纵坐标、芦丁浓度为横坐标，得出标准曲线及回归方程。通过图1可知其标准回归方程为Y=16.579X+0.003 1（R2=0.999 8）。以此方程计算提取液黄酮的浓度。

2.3 方差分析

为了检验方程的有效性，对FDL提取的数学模型进行方差分析，并对各因子进行显著性检验，结果发现，

一次项中X3的回归系数极显著，说明料液比对FDL提取有极显著影响；交互项的偏回归系数不显著；提取时间、提取温度、料液比和乙醇浓度二次项的偏回归系数达到高度显著水平。模型具有高度的显著性（P<0.000 1），且失拟项（P>0.05）不显著以及R2Adj =0.635 1和S/N（信噪比）为7.952远大于4，可知回归方程拟合度和可信度均很高，试验误差较小，可用此模型对FDL提取工艺进行分析和预测。

经过回归并优化，FDL最佳提取工艺参数为：浸提温度74.2 ℃、乙醇浓度79.2%、料液比1.0 ∶36.5、浸提时间3.28 h。在此最佳工艺条件下，其提取率可达到7.21%。经过验证试验得出实际测得平均提取率为7.18%，其相对误差特别小。

2.4 响应曲面图分析

通过二次多项回归方程所做的响应曲面图见图2，该组动态图可对任何两因素交互影响FDL提取率进行分析与评价，并确定最佳因素范围。图2中6个响应面图分别显示了提取时间和提取温度、提取时间和料液比、提取时间和乙醇浓度、提取温度和料液比、提取温度和乙醇浓度、料液比和乙醇浓度对龙竹FDL提取率的交互影响。由图2可知，提取率随其中任意2个变量增加所呈现出来的趋势。对回归方程求解并进行3次验证试验，得出FDL的最佳提取工艺条件为提取时间3.28 h、提取温度74.2 ℃、料液比1.0 ∶36.5、乙醇浓度79.2%，在此提取条件下，黄酮提取率为7.21%。

2.5 FDL对DPPH自由基清除能力的测定

由图3可知，随着FDL浓度的增加，清除率也逐渐增强，当清除率达到50%时，FDL浓度为149.17 μg/mL，在同等条件下与对照组VC比较，在100 μg/mL之前，清除DPPH自由基的能力明显不足，但随着FDL浓度的增加，其对DPPH自由基的清除作用明显增加，并接近VC。由此可见，在一定浓度范围内，FDL对DPPH自由基有很好的清除作用。

2.6 FDL对超氧阴离子自由基清除能力的测定

由图4可知，当FDL浓度增加到250 μg/mL时，其清除率可达到5135%以上。同等条件下与VC比较，其对超氧阴离子自由基的清除能力相当，VC的效果更好一些；随着FDL浓度的增加，两者对超氧阴离子自由基的清除作用不断加强。由此说明，在一定浓度范围内，随着FDL浓度的增加，其对超氧阴离子的清除作用也逐渐增强，并接近VC。

2.7 FDL对羟自由基清除能力的测定

由图5可知，随着FDL浓度的增加，其对羟自由基的清除作用缓慢增强，但当其浓度达到600 μg/mL时，其清除率就保持在40%左右；同等条件下与VC比较，VC的清除作用明显较强且一直保持较强的清除力。由此可见，在一定浓度范围内，FDL对羟自由基具有一定的清除作用，与VC比较，其能力明显不足。

3 结论与讨论

在单因素试验的基础上，以FDL的提取量为指标，通过四因素三水平响应面试验设计及分析方法，对龙竹FDL提取工艺进行了优化，得到其最佳提取工艺为浸提温度74.2 ℃、乙醇浓度79.2%、料液比1.0 ∶36.5、浸提时间3.28 h。

抗氧化研究表明，龙竹FDL对DPPH自由基、超氧阴离子自由基具有较好的清除作用，对羟自由基具有一定的清除作用。同等条件下与VC比较可知，随着FDL浓度的增加，其对自由基的清除作用逐渐加强，并接近VC的清除作用。

参考文献

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