甘草硒糖蛋白的制备工艺及对DPPH的清除作用研究

廉亚楠 赵胜男 李国清 2，彭 翔 李建惠 高金波

摘要 [目的]考察甘草硒糖蛋白的制备工艺，探究其对DPPH自由基的清除作用。[方法]在硝酸催化剂的作用下加入亚硒酸钠，使甘草糖蛋白与亚硒酸钠作用，生成甘草硒糖蛋白，用HPLC法检测硒含量，以产率和硒含量为指标，确定其合成的最佳工艺。采用分光光度法测定甘草硒糖蛋白、甘草糖蛋白和Vc对DPPH自由基的清除能力。[结果]甘草硒糖蛋白的最佳制备工艺条件：甘草糖蛋白与亚硒酸钠的质量比为1∶1，反应温度为70 ℃，反应时间为8 h，BaCl2的量为1.0 g。在此条件下制备的甘草硒糖蛋白，硒含量平均为4.78 mg/g，平均产率为75.62 %。对DPPH自由基的清除能力的试验结果：甘草糖蛋白、甘草硒糖蛋白和Vc的IC50值分别为1.789、1.410和0.427 mg/mL。[结论]该制备方法简单易行，安全，污染较小，硒含量较高；且甘草硒糖蛋白清除DPPH自由基能力强于甘草糖蛋白。

关键词 甘草；糖蛋白；硒化；DPPH

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）27-0017-04

Selenization and Scavenging Activity to DPPH of Licorice Glycoprotein

LIAN Yanan1，ZHAO Shengnan1，LI Guoqing2 et al

（1.Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154007；2.Harbin University，Harbin，Heilongjiang 150000）

Abstract [Objective]The selenization process of glycyrrhiza glycoprotein was investigated and its scavenging effect to DPPH free radical was explored. [Method]Under the action of nitric acid catalyst， adding sodium selenite performed licorice glycoprotein structure modification， generated selenide licorice glycoprotein. Selenium content of organic selenium compounds was detected by HPLC to determine the optimum process， yield and selenium content for indicators. Spectrophotometry was used to determine DPPH free radical scavenging activity of licorice selenium glycoprotein， licorice glycoprotein and Vc. [Result] The optimum process for selenide licorice glycoprotein was reaction temperature of 70℃ and time of 8 hours， the mass ratio of icorice glycoprotein to sodium selenite 1∶1， amount of BaCl2 1.0 g. Under these conditions， the average selenium content was 4.78mg / g， and average extraction rate was 75.62%. Scavenging activity of licorice selenium glycoprotein， licorice glycoprotein and Vc to DPPH radical scavenging ability respectively were 1.789 mg/mL，1.410 mg/mL and 0.427 mg/mL. [Conclusion] Process of glycoprotein selenium was simple， and easy to control， it also polluted less，content of selenium was high. Licorice selenium glycoprotein scavenging DPPH free radicals was stronger than licorice glycoprotein.

Key words Licorice；Glycoproteins；Selenization；DPPH

基金项目 黑龙江省中医药科研项目 （ZHY16-115）。

作者简介 廉亚楠（1993—），女，河南焦作人，硕士研究生，研究方向：天然产物药物分析。*通讯作者，教授，从事天然产物药物分析研究。

收稿日期 2018-05-22；修回日期 2018-05-28

甘草（liquorice root），为多年生草本，其根以及根状茎很粗壮，具有多种药理活性[1]。糖蛋白（glycoprotein）是由寡糖和蛋白质以多肽链共价修饰连接而形成的一类重要生理活性物质，它广泛存在于植物、动物体内[2]。近年来，从植物中分离的糖蛋白日益增多，由于糖蛋白具有種属专一性，决定了不同植物的糖蛋白具有不同特性[3]。糖蛋白的活性受到其分子结构的影响很大，对糖蛋白分子进行适当的结构修饰，引入某些化学基团，如乙酰基、羧甲基、磷酸根等，不仅使糖蛋白的结构，理化性质发生变化，还在一定程度上改变了生物活性[4]，对于糖蛋白构效方面的研究，这种化学修饰具有重要的意义。硒是人体必须的微量元素，对40多种危害人类生命和健康的疾病，如克山病大骨节病[5]、糖尿病、心脏病、癌症[6-8]等，都有良好的疗效。无机硒是有毒的硒，经过生物转化变成有机硒，毒性降低[9-10]。为降低无机硒化物的毒性，以甘草糖蛋白为原料，在一定条件下使其与亚硒酸钠结合，制备出甘草硒糖蛋白（UGC-Se），在制备过程中，先采用单因素方法考察温度、催化剂、反应时间、原料配比等因素对制备UGC-Se产率和硒含量的影响，然后进行正交设计和正交试验；在此基础上，考察UGC-Se对DPPH自由基的清除作用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

試验材料：甘草糖蛋白，用超临界CO2辅助水提醇沉法优化条件提取，又经DEAE-52和SephadexG-75分离纯化得到。试剂：亚硒酸钠（分析纯，上海新宝精细化工），邻苯二胺（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），抗坏血酸（分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司），浓硫酸（分析纯，北京化工厂），氯化钡（分析纯，北京化工厂）。试验仪器：UV757CRT型紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），AgiLent 1100型高效液相色谱仪（AgiLent公司），分析天平（FA2004型，上海恒平科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 硒含量的检测。

1.2.1.1 色谱条件。

色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18（520 mm×4.6 mm）；流动相为甲醇∶水=45∶55；检测波长为330 nm；流速1.0 mL/min；柱温：室温；进样量10 μL。

1.2.1.2 样品的处理方法。

准确称取50 mg甘草硒糖蛋白放入试管中，加入消解液1 mL[浓硝酸∶浓硫酸=1∶1（V/V）]冷消化过夜，100 ℃水浴加热6 h。当黄褐色气体全部排尽后，冷却至室温，加入6 mol/L HCl溶液2.5 mL，沸水浴加热至溶液呈无色或淡黄色，冷却，定容至10 mL容量瓶。

1.2.1.3 检测方法。

取pH 2.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液3.0 mL置于试管中，取消解后的溶液1.0 mL，加入1.0 mg/mL邻苯二胺溶液1.0 mL，在40 ℃反应100 min后取出冷却至室温，加磷酸氢二钠溶液调pH至中性，然后将反应液转入10 mL容量瓶，定容，过滤，10 μL进样，读取色谱峰面积。

1.2.1.4 硒标准曲线的绘制。

准确称取一定质量的亚硒酸钠放入试管中，按“1.2.1.2”进行处理，处理后配制成终浓度分别为0.2、0.6、2.0、6.0、10.0、30.0、50.0 μg/mL的亚硒酸钠标准系列溶液，再按检测方法进行操作，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制硒标准曲线。

1.2.2 UGC-Se的制备工艺。

称取一定质量的甘草糖蛋白置于三颈瓶中，加2%醋酸溶液50 mL，加热搅拌使其溶解，加入一定比例的Na2SeO4，加入一定质量的BaCl2作为催化剂，反应2 h后，逐滴加入10%硝酸2 mL，在一定温度下反应一段时间，冷却至室温。滴加1 mol/L硫酸至无新沉淀产生为止，离心，除去催化剂，用无水Na2CO3调节pH至5～6，流水透析36 h以上，除去游离Se元素，80%以上醇沉静止过夜，离心，干燥，得UGC-Se，称重，计算产率，检测硒含量。

1.2.3 制备工艺的单因素试验。

1.2.3.1 原料配料比。

按“1.2.2”方法，甘草糖蛋白与Na2SeO4的质量比分别为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1；加入BaCl2的量为0.5 g，反应时间为8 h，反应温度为70 ℃，进行制备。

1.2.3.2 反应温度。

按“1.2.2”方法，甘草糖蛋白与Na2SeO4的质量比为1∶1，BaCl2的量为0.5 g，反应时间为8 h，其反应温度分别为50、60、70、80、90 ℃，进行制备。

1.2.3.3 反应时间。

按“1.2.2”方法，甘草糖蛋白与Na2SeO4的质量比为1∶1，BaCl2的质量为0.5 g，反应温度为70 ℃，反应时间分别为6、7、8、9、10 h，进行制备。

1.2.3.4 BaCl2用量。

按“1.2.2”方法，甘草糖蛋白与Na2SeO4的质量比为1∶1，反应温度为70 ℃，反应时间为8 h，BaCl2的用量分别为0.25、0.50、1.00、1.25、1.50 g进行制备。

1.2.3.5 正交试验。

选择配料比（A）、反应温度（B）、反应时间（C）、BaCl2用量（D）为考察因素，按L9（34）正交设计制备UGC-Se（表1）。

1.2.4 UGC-Se红外光谱测定。

用FTIR-8900红外光谱仪，采用KBr压片，测定甘草糖蛋白和甘草硒糖蛋白的红外光谱图。

1.2.5 UGC-Se对DPPH自由基的清除作用。

取10 mL试管，依次加入2 mL不同浓度（1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mg/mL）的样品溶液，再分别加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，均匀混合，在37 ℃恒温水浴锅中加热，注意避光，30 min后，在517 nm处，测定吸光度As；取相应浓度的样品液2 mL，加入2 mL无水乙醇，在37 ℃恒温水浴锅中加热，避光，30 min后，在517 nm处，测吸光度Ax；取2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，加入2 mL蒸馏水，在37 ℃水浴锅中加热，避光，30 min后，在517 nm处，测吸光度A0。以Vc为阳性对照。按如下公式计算样品对DPPH的清除率，并计算其IC50值。

DPPH清除率=A0-（As-Ax）A0×100%

2 结果与分析

2.1 硒含量的标准曲线

根据硒标准曲线绘制的方法，得出标准曲线方程：Y=11877x+24.09，相关系数为r =0.999 2，在0.2～50.0 μg/mL线性范围内，线性关系良好，可以用于硒含量的测定。

2.2 制备工艺单因素试验结果

2.2.1 物料比对UGC-Se产率及硒含量的影响。

如图1所示，甘草糖蛋白和亚硒酸钠的质量比分别为3∶1、2∶1、1∶1时，硒含量及产率逐渐增大，当1∶1时，硒含量及产率达到最高；而后，随着亚硒酸钠质量的增加，硒含量及产率反而降低，说明甘草糖蛋白与亚硒酸钠之间的反应存在相互依存的关系。

2.2.2 反应温度对UGC-Se产率及其硒含量的影响。

如图2所示，温度增加反应速度加快，在60～90 ℃的范围内，UGC-Se的硒含量随温度的升高而降低；其产率随温度的升高先增加，70 ℃时，达到最大，温度再升高对产率的影响较小；综合考虑以70 ℃为宜。

2.2.3 反应时间对UGC-Se产率及其硒含量的影响。

如图3所示，UGC-Se产率和硒含量，均随着时间的增长呈现先增大后降低趋势；反应7 h时，产率达到最大；反应时间为8 h时，硒含量达到最大。

2.2.4 BaCl2用量对UGC-Se产率及其硒含量的影响。

2.3 正交试验优化反应因素结果

根据正交设计进行正交试验的结果列于表2，方差分析结果列于表3。

由表2可知，影响UGC-Se产率的4个因素大小为：B>A>D>C，说明反应温度对产率的影响最大，其次是配料比，最佳工艺条件是A2B2C2D3。而影响UGC-Se硒含量的4个因素由大到小为A>C>D>B，即甘草糖蛋白和亚硒酸钠的质量比是影响硒含量的主要因素，其次是反应时间，最佳工艺条件是A2B3C2D2。由于在两者的最佳工艺中，只有B和D不同，而两者都不是最主要的影响因素，综合两者的影响效应得最佳制备工艺条件为A2B2C2D3。

2.4 工艺条件验证试验结果

根据上述优化结果，在配料比为1∶1，反应温度为70 ℃，反应时间为8 h，BaCl2量为1.0 g的优化条件下，制备3批UGC-Se，平均硒含量为4.78 mg/g，平均提取率为75.62%，表明此条件下制备的UGC-Se的产率及硒含量均较高。

2.5 甘草硒糖蛋白的红外光谱法表征

如图5所示，硒化反应前后，甘草糖蛋白的红外光谱发生变化。对图5 进行解析，3 444、2 927、1 625、1 429和1 018 cm-1附近的吸收峰为多糖和蛋白质的特征吸收峰，而3 444 cm-1左右吸收峰为 O—H的伸缩振动，是由于分子内氢键的形成，使峰变宽，2 927 cm-1处的吸收峰较弱，是C—H伸缩振动，以上2处吸收峰为多糖的特征峰；1 625 cm-1处为CO的伸缩振动和N—H的变角振动，1 429 cm-1是C—H的变角振动引起的，以上2处为蛋白质的特征吸收峰；在1 000～1 200 cm-1处的C—O键的吸收峰，说明糖蛋白中含吡喃环。在1 751 cm-1处多出的峰为SeO的特征峰，1 253和410 cm-1处的峰增强，说明含有Se—C的存在，1 330 cm-1处多出峰为Se—O—C特征吸收峰，证明成功制备了UGC-Se。

2.6 DPPH清除结果

不同浓度的UGC-Se清除DPPH的结果见图6。

结果表明，在1.0～1.8 mg/mL的浓度范围内，甘草糖蛋白和甘草硒糖蛋白的最高清除率分别为50.55 % 和70.65 %，Vc在0.2～1.0 mg/mL时，最高清除率为93.98 %，其IC50值分别为1.789、1.410和0.427 mg/mL。

3 结论

通过单因素试验和正交试验对制备过程进行优化，得到甘草硒糖蛋白的最佳制备条件为甘草糖蛋白与亚硒酸钠的质量比为1∶1，反应温度为70 ℃，反应时间为8 h，BaCl2的量为1.0 g，用乙醇进行醇沉，在此条件下制备的甘草硒糖蛋白，测得其平均硒含量为4.78 mg/g，平均产率为75.62%。研究表明，该试验的制备方法具有仪器简单、反应条件容易控制、反应效果好、可操作性强等优点。在1.0～1.8 mg/mL时，UGC-Se对DPPH自由基的最高清除率为70.65%，其IC50值为1.410 mg/mL，表明具有一定的抗氧化能力，可为甘草糖蛋白的进一步研究提供理论基础。

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