非洲猪瘟的诊断和防治

贾良梁

摘  要：本文是《非洲猪瘟及其传入美国的趋势以及随后在野猪和当地蜱中确立的可能性（综述）》的第三部分，重点介绍非洲猪瘟的诊断、疫苗研发和防治策略。

关键词：非洲猪瘟;诊断;防治;疫苗

中图分类号：S855 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）12-0007-04

1  诊断

病毒分离可以用于非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）的诊断，因为活的病毒可以从活的动物或剖检组织中分离到，不过这种方法通常仅用于参考，需实验室进行确诊。脾脏、肾脏、扁桃体和淋巴结是收集非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）的最佳组织。猪白细胞、骨髓培养物、猪肺泡巨噬细胞和猪血单核细胞都可以用于ASFV的培养。研究人员已经开发了可用来检测ASFV的传统实时定量PCR法，同时开发了多种引物，以便构建快速检测工具。人们已经可以在ASFV感染下幸存的家猪体内检测到强烈的IgG反应。同时，血清学分析也是非常有用的方法，尤其在非洲猪瘟呈地方性流行的地区。酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、免疫印迹和间接荧光抗体分析是最常用的方法，ELISA再联合免疫印迹经常出于国际贸易的目的被利用。

2  疫苗

研发有效的ASF疫苗相当具有挑战性。到目前为止，由于受一些关键因素的影响全世界尚没有可用的疫苗，这些因素包括保护性抗原的鉴定不足、对病毒-宿主细胞相互作用的了解不完全和对关于当前在自然储库中流行的毒株多样性的了解不充足。研究人员已经尝试了一些疫苗方案，并且获得了不同程度的成功，包括运用自然或试验敲除基因的疫苗、基于重组蛋白的亚单位疫苗和DNA疫苗。然而，这些疫苗均无法提供完全的保护力。研究人员开发了一种弱毒活疫苗，对同源毒株攻毒能产生免疫保护;然而，在伊比利亚半岛的使用被认为已经成为1960年到1995年期间引发慢性型非洲猪瘟的一些低毒力毒株的来源。尽管这次尝试受挫，但是研究人员仍继续对弱毒疫苗的保护力进行了评估。

研究人员已经评估了ASFV基因敲除突变株的免疫效力，不过获得的结果不一致。Afonso等介绍了被称为NL的一个高保守基因，并发现将ASFV欧洲致病性毒株中的该基因剔除会使该病毒在家猪体内完全弱化。研究人员为非洲猪瘟的高毒力非洲株构建了两个NL敲除突变株，接种家猪后发现不论NL缺失与否这些毒株均保持毒力。这些发现表明，NL基因的功能不是这些ASFV毒株需要的，仅敲除NL基因不足以设计出ASFV弱毒疫苗。9GL基因高度保守，体外评估表明该基因编码的蛋白质会影响巨噬细胞培养的病毒粒子的成熟和病毒的生长。9GL基因的敲除会使病毒在培养中产生生长缺陷的突变株，并发现在家猪中高度弱化。接种9GL基因敲除的病毒后再用野生型ASFV毒株攻毒，结果会产生充足的保护力，研究人员正在对该毒株作为ASFV疫苗候选毒株进行进一步的评估。9GL基因也高度保守，研究发现剔除后会造成病毒在家猪体内完全弱化。接种该突变株后再感染同源野毒株，结果会产生完全的保护作用。然而，值得注意的是，研究人员对抗ASFV的特异性抗体、ASFV特异性IFNγ反应和循环细胞因子水平进行评估后发现，不论感染确立与否均发生了复杂的免疫情况。

此外，A238L是一种能够抑制NF?B和NFAT通路活化的ASFV免疫调制蛋白，这两个通路负责调控促炎因子的合成。这种蛋白被认为是一种有效的免疫抑制因子，可能有助于病毒逃避宿主的免疫反应。不出所料，给猪接种ASFV的A238L突变毒株能够提高TNFα——一种有效的促炎因子——的水平。研究人员还需要进行更多的研究以确定用改变免疫调制蛋白的病毒进行免疫接种是否可以用于促进宿主对强毒攻毒的免疫反应。

研究人员已经利用多种恰当的病毒蛋白对重组蛋白疫苗进行了定性。p30蛋白和p54蛋白位于病毒表面，且分别参与病毒附着和病毒内化。给家猪接种重组的p54蛋白或p30蛋白能够诱导其产生中和抗体，但是不能使猪对致死剂量的攻毒产生免疫力且病程不变。接种联合了p54蛋白和p30蛋白的疫苗不仅能使动物产生中和抗体而且还会改变病程，产生一系列保护。Ivanov等对能够模拟病毒蛋白的46个缩氨酸建立一个保护性免疫反应的能力进行了评估。研究发现，给家猪接种这些缩氨酸的混合物可以推迟动物的死亡，但有待进一步研究。研究人员将可以表达ASFV血凝素的杆状病毒载体用作疫苗，结果所有猪在免疫后都抗过了强毒毒株的攻毒。

研究人员也将作为ASF疫苗候选者的DNA疫苗进行了评估，在构建疫苗时将p54蛋白和p30蛋白用作抗原可提供部分保护。CD8+细胞的强力激活对于激发保护似乎至关重要。

感染葡萄牙的ASFV无毒力毒株（OURT88/3 基因1型），随后感染其有毒力的毒株（OURT88/1基因1型），结果接种动物对ASFV的非洲野外分离株产生了免疫保护。这种免疫策略可防止大多数猪发病和出现病毒血症。多个ASFV毒株的交叉反应性可以通过IFNγ刺激实验检测，并与产生的保护程度高度相关。

除了评估新的疫苗产品外，Blome等使用先进的佐剂尤其是多价抗体和Emulsigen-D再次评估了ASFV灭活疫苗制剂的功效，后两种佐剂被认为可以刺激体液免疫反应和细胞免疫反应，包括IFNγ。ASFV灭活疫苗的免疫效力没有提高，动物免疫后再用相同的毒株攻毒后未能产生保护作用。事实上，免疫的动物发病更快，这表明抗體依赖性有增加的可能性。

ASFV的疫苗研发正在进行中且富有挑战性，因为遗传和抗原变异范围广以及病毒为逃避宿主免疫反应采取的策略众多。要开发一种既具有生物安全性又能为ASFV各种强毒毒株提供高水平交叉保护的疫苗需要进一步研究。该论题专家认为，弱毒活疫苗因其在实验上取得的成功在短期内是最有应用前景的疫苗，然而，如果需要确定疫苗的安全性、鉴别自然感染和免疫接种动物（Discrimination of Infected from Vaccinated Animals，DIVA）的能力和长期效力则需要进行更多的研究。

3  结论

美国农业部兽医局已经出台了针对家猪经典猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）的监督方案，在传入风险提高的疫情中，家猪可以用于评估ASFV。具体内容如下：（1）监督美国猪群中CSFV的快速检测;（2）监测经典猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）传入美国猪群的风险;（3）监测国际CSF疫情;（4）监督明确CSF的自由度。那些增重困难，换言之，有点生病的猪，被称为僵猪，通常被卖给非流通市场的小贩。美国动植物卫生检验署（Animal and Plant Health Inspection Service，APHIS）兽医局职员或其辅助人员收集这些市场上的猪扁桃体样本作为调查病原体包括CSFV的一种方法。该方法被视为一种有效的监督策略，因为来自周边地区生产性能欠佳的猪通常集中在这些市场中，这使得该方法成为采集来自更广泛区域病猪样本的一种有效手段。此外，饲喂泔水的猪场、庭院式猪场、野猪猎捕俱乐部、军事基地、国际机场或码头、雇佣国际劳动力的农场以及/或从事跨国生猪转运的组织所在的地区被APHIS认定为暴发非洲猪瘟的高风险区，这些地区属于扁桃体采集的经常性监督范围;美国25个州被视为高风险地区。在美国，所有用泔水饲喂的猪场需要获得批准并需定期检查，所有饲料均需强制进行热处理。德克萨斯和佛罗里达州被认定为暴发非洲猪瘟的极高风险区;同样，APHIS会对佛罗里达州的2个和得克萨斯州的3个屠宰场随机采集血样，采集的样本会送至外来动物疾病诊断实验室（Foreign Animal Disease Diagnostic Laboratory，FADDL）以备进一步检测，尤其是来自各州南部地区体重轻的或处于转移期的猪样本。对家猪进行经常性的CSFV监督机制可以立即扩展到对ASFV的监督中，因为样本已经采集到且送至FADDL用于筛查。

需要注意的是，ASF在东欧和高加索地区的传播大多数很可能是受到人为因素的驱动，如感染猪和产品的运输以及饲喂泔水。然而，蜱的作用不能忽视，因为它们造成了ASFV在葡萄牙流行超过6年之久，当时该国仅单个猪场重新出现该病，在此之前宣布无ASF。人们往往很少了解媒介在病原维持和传播中的作用，而这些寿命长的蜱协同可能会促进ASFV传播的人类活动在ASF的暴发上起着重要的作用。

对非法进口和随后充公的、意外死亡的野豬及其产品抽样也将会提供与传入病原的类型相关的有效数据。据美国审计总署（General Accounting Office）估计，旅客携带的非法进口野生动物中仅1%～3%被查获，1%～10%非法进口野生动物公然以货物运输。Smith等进行了一项初步研究，评估来自纽约州纽约市约翰肯尼迪机场的充公动物产品中的动物传染病病原，结果发现多种逆转录病毒和疱疹病毒毒株出现在一些非人灵长动物样本中。有关以非法进口猪肉产品的方式传入美国的病原体类型的知识，对了解猪特异性病原和动物传染病病原风险可能非常有帮助。

ASF对家猪和野猪物种的健康均会构成实质性威胁。对ASFV传入美国的担心已经促使人们采取了一系列用于活体动物及其产品进口的预防措施。尽管人们对ASFV进行了大量的研究，但是研究的不足仍然存在，它们已被列为进一步评估的重点领域。