细菌产生的纤维素酶(综述)(续2)

严鸿林

摘  要：本期主要介绍纤维素酶在细菌体系中的作用方式、细菌共培养以及纤维素酶基因在异源宿主中的克隆与表达。

关键词：纤维素酶;共培养;克隆;细菌

中图分类号：S851.6 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）12-0018-03

6  纤维素酶在细菌体系中的作用方式

研究人员关注对纤维素特异性黏附有重要作用的四种结构：（1）被称为纤维小体的大型多组分复合物;（2）菌毛或菌毛黏連;（3）细菌糖萼层表面的碳水化合物;（4）酶结合结构域。

6.1 通过类纤维体复合物的黏附

纤维小体是大的、稳定的多酶复合物，特异性地黏附和降解位于细胞表面上可见突起的纤维素。多纤维素酶复合物由包含纤维素结合结构域和多附着位点（称为黏附素）的中央非催化亚基（称为支架蛋白）组成，附着位点用于结合酶促递送。酶促提交物包含催化结构域和对接结构域[称为码头蛋白（dockerin）]，后者与支架蛋白上的内聚相互作用。研究最彻底和最好的纤维小体是嗜热细菌热纤维梭菌。

6.2 通过纤毛黏附

纤毛参与表面附属物的细菌黏附。革兰氏阴性菌中纤毛的宽度为5 nm～7 nm，长度为100 nm～200 nm。随着对纤毛在细菌黏附作用中了解的加深，我们清楚地认识到纤毛的结构亚单位负责细菌黏附。革兰氏阳性菌黏放线菌和血链球菌中纤毛的一些亚基单位已经被鉴定。大肠杆菌具有三种类型的纤毛，其碳水化合结合位点均在纤毛小的（28 kDa～  35 kDa）重复亚基中，并且大部分位于纤维的唇部，剩余的重复亚基位于纤毛其他位置。在白色瘤胃球菌中，一种新型的纤维素结合蛋白（cbpC，17.7 kDa）已经被认为属于丸蛋白，并且最类似于革兰氏阴性致病菌的4型菌毛蛋白。

6.3 通过细菌糖萼的碳水化合物表面黏附

电子显微镜观察发现了大部分有关通过碳水化合物表位黏附的证据。许多研究表明，围绕白色瘤胃球菌和瘤胃黄瘤菌的黏液层由糖蛋白（碳水化合物残基）组成，参与细菌的黏附。如果用蛋白酶和葡聚糖酶处理通过高碘酸盐氧化去除糖萼碳水化合物，那么白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌对纤维素的黏附会显著降低。更多的碳水化合物黏附作用的直接证据在纤维杆菌中已给出。

6.4 通过纤维素分解酶的纤维素结合域黏附

已经揭示了在纤维素酶结构中发现的两个功能域，即负责水解切割糖苷键的活性催化结构域和将细菌酶结合到其底物上的结合结构域。在许多情况下，纤维素结合结构域通过富含羟基氨基酸的接头与催化核心连接，并且大多数纤维素结合结构域具有四个保守的色氨酸和两个另外的半胱氨酸残基。由于保守的芳香族残基，人们认为纤维素结合结构域通过氢键或疏水相互作用连接到纤维素上。已经有研究表明，缺乏这些结构域的细菌黏附性较差，在某些情况下，其消化晶体纤维素的能力较差。人们已经在产琥珀酸丝状杆菌中鉴定了不同的结合结构域，包括内切葡聚糖酶2和EGF。Karita等克隆了来自白色瘤胃球菌F-40的基因egVI，发现该酶含有不同的纤维素结合结构域。

7  共培养

细菌共培养用于改善纤维素的水解和提高产物利用率以获得更值得需要的发酵产物。热纤梭菌有其优势与能够将戊糖发酵成乙醇的生物进行共培养，因为热纤梭菌只能发酵己糖。因此，热纤梭菌已经与其他厌氧嗜热梭状芽孢杆菌、热硫化氢梭菌和布氏热厌氧杆菌培养。这些生物体具有与厌氧嗜热梭状芽孢杆菌共生的能力，可用于纤维素和半纤维素的水解，最终转化成乙醇（图2）。共培养的优点是增加产量，但挑战是副产物（如乙酸和乳酸）的产生，通过影响细胞的生长速率来降低乙醇产量。开发细菌共培养是一项艰巨的任务。培养基和生长条件，如温度/空气和碳源必须是同步的，因为保证每个菌株的均匀生长是建立共同培养所必需的。稳定的共同培养也可以通过更特定地控制代谢相互作用（即相互关系或相互作用）和其他相互作用（即生长促进或生长抑制如抗生素）来实现。

细菌共培养的替代途径是基因工程菌的开发，这种菌能够从头到尾完成纤维到乙醇的转化。这意味着，代谢工程改造的热纤梭菌可以发酵戊糖和己糖，但是，由于梭菌对遗传操作的顽固性，对梭状芽孢杆菌的分子改造将是一项艰巨的任务。因此，共培养具有优势，因为它可以减少由单个细菌群体产生的外源性产物的量，从而减少宿主细胞代谢失衡的机会。此外，分工将优化每个反应路径。尽管细菌共培养是生物转化木质纤维素生物质的一个常见的概念，但尚处于不成熟的阶段，并且具有很大的潜力。

8  纤维素酶基因在异源宿主中的克隆与表达

Pasternak和Glick已经综述了纤维素酶基因在细菌宿主中的克隆和表达。Forsberg等综述了细菌纤维素酶的特性和克隆，特别是来源于瘤胃厌氧菌产琥珀酸拟杆菌。其中最重要的是：（1）由于原核与真核生物翻译机制的差异，从真核宿主中克隆纤维素酶基因不能直接在原核细胞中表达;（2）由于与原核生物相比真核基因组更大，来自真核细胞的基因组克隆库需要用长度为20 kb～40 kb的DNA来构建。像pBR322这样的载体插入片段大于10 kb～15 kb的DNA不能很好地复制和得到令人满意的结果。重组纤维分解策略将非纤维素分解微生物改造成可分解纤维微生物涉及功能性纤维素酶系统的异源表达。这种异源表达已在各种微生物中构建来实现多种用途。

8.1 异源纤维素酶在细菌中的表达

8.1.1 运动发酵单胞菌

一些纤维素酶编码基因已经在运动发酵单胞菌中克隆和表达，并取得了不同程度的成功。通过可移动的质粒载体将来自荧光假单胞菌的内切葡聚糖酶基因（eglX）引入运动发酵单胞菌。然而，该重组菌株在整个生长期在细胞内异源内切葡聚糖酶的产生与培养基中的葡萄糖浓度无关。类似地，将枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶导入运动发酵单胞菌中该酶表达量低，并且在转化体的培养上清液中也没有检测到活性。

与上述荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌基因相反，菊欧文氏菌的内切葡聚糖酶基因（celZ）可在运动发酵单胞菌中有效表达。运动发酵单胞菌所产酶的活性与菊欧文氏菌的亲本菌株相当。据报道，内切葡聚糖酶基因的生物合成发生于运动发酵单胞菌的指數生长期期间，约35%的酶释放到培养基中而不参与细胞裂解。另一个纤维素酶基因已被成功克隆，并在运动发酵单胞杆菌中表达。来自木质醋酸菌的CMCase基因在运动发酵单胞菌中有效表达，并且在周质间隙中检测到约75%的酶活性。

8.1.2 肠原杆菌

由celY和celZ编码的两种菊花内切葡聚糖酶和木质醋酸菌的纤维素酶基因已经在大肠杆菌以及相关肠杆菌产酸克雷伯氏菌中有表达。由于启动子构建，celY最初在大肠杆菌中的表达很差。然而，通过使用来自运动发酵单胞菌的替代启动子，大肠杆菌中celZ的表达增加了6倍。

9  纤维素酶生物技术：未来

使用木质纤维素材料或其他化学原料生产乙醇是生物技术史上遇到的最困难的任务之一。通过对培养物中的酶进行定量、纯化、鉴定和应用来研究微生物纤维素的利用，这同时也是微生物生物技术的重要方面之一。纤维素水解的定量描述包括纤维素酶的吸附、酶水解速率、微生物纤维素利用的生物能量学以及与可溶性底物动力学对比的特征。从生物学角度来看，纤维素生物质的处理具有预处理底物和替代工艺配置的特点。生物体发育被认为是“整合生物加工”，其中纤维素分解酶的生产、生物质的水解和糖发酵成所需产物在一步发生。我们对两种生物开发策略的“整合生物加工”进行了审查：（1）可改善能够利用纤维素的微生物的产物产量和耐受性;（2）实现纤维利用分解菌的高产和耐受性酶体系的异源表达。

10  结论

微生物转化纤维素生物质是开发新型生物工艺和产品潜在的可持续方法。目前，微生物纤维素酶正在全球多个行业进行商业化生产，并在食品、动物饲料、燃料、造纸业、纺织业以及各种化学工业中得到广泛应用。纤维素酶研究主要集中于真菌，但由于细菌具有较高的生长速率、热稳定性和碱稳定性，因此人们对用细菌产生纤维素酶的兴趣也在增加。在不适宜环境中筛选来自微生物的纤维素酶的快速和可靠方法的发展将允许更多数量的新型细菌纤维素酶被分离出来用于工业用途。我们目前对这些酶和生产菌的生产、纯化、鉴定、生物化学、分子生物学的认识是可观的。然而，通过合理的设计，可以利用现有的酶结构和功能知识来进一步设计这些新型酶。或者，可以通过随机诱变技术对其改进，重点是要通过定向进化选择理想的性状加以增强。此外，通过蛋白质工程改善细菌纤维素酶活性或赋予所需的酶特征可能是纤维素酶研究的另一个领域。尽管迄今为止我们取得了细菌纤维素酶的一些研究进展，但对纤维素酶和细菌还需要付出更多的努力才能产生重要的工业影响。

（续完）