白芨种子无菌萌发及其无性繁殖体系的研究

郄亚微

摘 要 为实现白芨的快速繁殖和工厂化生产，以白芨的成熟蒴果为材料，在MS、1/2MS添加6-BA的培养基上进行无菌播种。将种子萌发后形成的原球茎接种到不同培养基上进行扩增繁殖，建立白芨无性繁殖体系。结果表明：种子萌发最佳培养基为培养基1/2MS+6-BA1.0 mg·L-1，它能有效提高萌发率，促进原球茎的生长；无性繁殖最佳培养基为MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1。此体系的建立有助于白芨的相关研究和产业化。

关键词 白芨；种子萌发；无性繁殖体系

中图分类号：S567.23 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.29.094

白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]是兰科白芨属多年生草本植物，极具经济价值。其块茎为我国传统名贵的中药，有收敛止血、消肿生肌的功能，可治咳血吐血、外伤出血、溃疡病出血、肺结核吐血、疮疡肿毒等疾病，同时花色艳丽，也是一种观赏极佳的景观植物。

白芨分布较广，在全国大部分省区均有分布，主产于四川、贵州、湖南、湖北、安徽、江苏、河南、云南、广西和浙江等省区。在野生状态下，白芨种子的自然萌发率极低，繁殖困难，只能依靠人工繁育来提高白芨产量。现在人工繁育的常规方法以分株为主，即将块茎分切成小块种植，但繁殖系数低、消耗量大，当发展大面积、规模化生产时，供种困难。另因生境遭受破坏和无序采挖，白芨野生资源严重匮乏，已被国家列为珍稀濒危植物。为满足市场对白芨药材的需求，保护野生白芨资源，利用组织培养方法构建白芨快速繁殖体系势在必行。本研究以白芨种子为起点，试图建立一套经济可靠的白芨组织培养体系，为实现白芨的快速繁殖和工厂化生产提供基础数据。

1 材料與方法

1.1 材料

试验材料为成熟未开裂的野生白芨蒴果，采于四川省广安市广安区崇望乡自力村山谷，地理坐标为东经106°38′、北纬30°35′，海拔410 m，中亚热带湿润季风气候区，气候温暖，热量充足，雨量丰沛，空气湿度大，日照少，霜期短，土壤类型为棕壤，pH值为6.7。

试验材料由广安新天地农业发展有限公司高级农艺师马晓彬鉴定。

1.2 方法

1.2.1 无菌播种

选取成熟未裂蒴果，用毛笔轻轻扫去附着在其表面的灰尘，流水洗净，在超净台内进行消毒处理，先用75%的医用酒精表面消毒30s，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒10 min，无菌水冲洗5～6次，置于无菌滤纸上吸干表面水分。在无菌条件下，用手术刀纵向剖开蒴果，用镊子夹取蒴果外壳，将种子均匀播种于培养基。播种后先将培养基置于暗条件下培养，种子萌发后再移至光照条件下，培养温度为（25±2）℃，光照时间10 h·d-1，光照强度1 500～2 000 lx。基本培养基采用MS、1/2MS的大量元素，每类基本培养基又分别添加6-BA浓度0 mg·L-1、

0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1。所有培养基均添加3%的蔗糖及0.6%的琼脂，pH值调至5.8。每个处理接种

5瓶，每瓶种子约为200粒，培养35天后，统计白芨种子的萌发率。

1.2.2 无性繁殖体系构建

种子萌发形成原球茎后，将原球茎转接到无性繁殖培养基上进行培养，培养基以MS为基本培养基，添加不同激素6-BA和NAA的组合配比，6-BA浓度设置三水平（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1），NAA浓度设置三水平（0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1），完全随机设计共9个处理，添加3%蔗糖及0.6%的琼脂，pH值调至5.8。培养温度（25±2）℃，光照时间10 h·d-1，

光照强度1 500～2 000 lx。每个处理接种10瓶，培养35天后，观察原球茎的生长状况和调查原球茎继代增殖

数情况。

2 结果与分析

2.1 白芨种子无菌萌发

黑暗培养10天后，在培养基中可观察到有少数种胚膨大，继而突破种皮开始萌发；转入光照培养后，种子开始颜色变绿，并有原球茎发育。白芨种子呈粉末状，解剖镜下观察，种子呈纺锤形，结构简单，由一层透明的种皮和1个种胚组成。白芨种子在自然条件下发芽率很低，影响其萌发的因素很多，有种皮的机械阻力和透水性差、种胚发育不全、贮存的营养物质过少以及可能存在抑制物质等。

2.2 基本培养基对白芨种子萌发的影响

接种10天后，两种基本培养基中的种子均有萌发。由表1可知，各处理中种子的萌发率以1/2MS培养基最佳。方差分析表明，培养基对种子萌发率的影响及其显著，采用1/2MS培养基，平均萌发率为74.73%，显著高于MS培养基，这也说明成熟种子的胚自身贮藏的营养可以满足种子萌发的需求。从种子萌发后幼苗生长情况看，1/2MS培养基处理后幼苗生长在整齐程度、高度、颜色等方面略优于MS培养基处理。

2.3 6-BA浓度对白芨种子萌发率的影响

由表1可知，处理7的种子萌发率最高，高达89.2%，且萌发后幼苗芽整齐，较粗壮，高约0.8 cm，颜色浓绿，部分有根毛长出。当6-BA浓度分别为0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、

1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1时，平均萌发率为58.15%、67.50%、79.45%、64.25%。通过多重比较，采用6-BA浓度1.0 mg·L-1时显著高于其他浓度水平，其他浓度水平之间差异不显著。故6-BA浓度为1.0 mg·L-1时，即为白芨种子萌发的最适浓度。

2.4 不同激素处理对白芨继代培养的影响

将原球茎转入扩繁培养基培养35天后，不同培养基中原球茎的增殖率及原球茎继代增殖倍数见表2。在培养基处理D中，原球茎增殖率达81.2%，增殖倍数达到3.7，为最高增殖倍数，且观察到原球茎颗粒饱满、状态良好，呈浓绿色，无分化现象，优于其他处理组合。即可筛选出MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1为最佳扩增繁殖培养基。实验中也发现原球茎增殖率较小的激素组合，原球茎会萌发形成幼苗。因此，在扩繁培养中，如将激素组合设定为6-BA1.0 mg·L-1+NAA

0.1 mg·L-1，可大量扩增原球茎；如将激素组合调整为6-BA1.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1，则利于植株生长，可获得白芨幼苗。

3 小结与讨论

1）选用大量元素减半的1/2MS培养基作为种子萌发的基本培养基，其盐分较低，有利于萌发，白芨种子的萌发率均达51.6%以上，最高可达79.2%。少数种子未能萌发的原因可能是在培养基中吸水分不足或胚的结构不完整。张建霞等[1]发现，白芨种子的有胚率与蒴果的胚龄有关，胚龄越长，有胚率越高。本试验所用的材料采集于野外，白芨蒴果已经成熟但未开裂，故有胚率较高，萌发率较高。

2）在无菌播种试验中，培养基均添加了单一激素6-BA，并设计了浓度梯度0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、

1.5 mg·L-1，结果表明：6-BA濃度为1.0 mg·L-1时种子萌发率最高，这与袁宁[2]、王楷[3]等的结果相似。此外，添加活性炭可以为培养提供暗环境，更有易于种子萌发及幼苗生长，添加浓度以0.1%为宜。

3）不同植物激素浓度及配比与原球茎的增殖有很大关系，原球茎的继代增殖需要浓度适宜的植物生长素和细胞分裂素共同作用。在原球茎扩增繁殖试验中，设计三个浓度（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）的6-BA和三个浓度（0.1 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1）的NAA进行组合配比，经过试验选出最适宜原球茎繁殖的培养基MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1。本试验结果中处理F：6-BA浓度为1.0 mg·L-1、NAA浓度为1.0 mg·L-1利于植株生长，可获得幼苗，为理想的生长培养基。

参考文献：

[1] 张建霞，付志惠，李洪林，等.白芨胚发育与种子萌发的关系[J].亚热带植物科学，2005，34（4）：32-35.

[2] 袁宁.白芨组织培养技术体系研究[D].成都：西南交通大学，2008.

[3] 王楷，李玥，张云峰，等.白芨种子高效萌发及其无性繁殖体系的构建[J].云南农业大学报，2006，21（2）：160-163.

（责任编辑：刘昀）