西藏一种芥菜型油菜PGIP基因的克隆与序列分析

庞博 刘何春

摘要 防治油菜菌核病的有效方法是培育抗菌核病的油菜品种。多聚半乳糖醛酸酶阻遏蛋白（polygalacturonase inhibiting protein，PGIP），是植物体内一种重要的抗真菌蛋白。本研究根据NCBI中发表的PGIP基因序列设计引物，从芥菜型油菜‘藏油6号中克隆得到全长1 048 bp的PGIP 基因序列。其核酸序列与NCBI数据库中登录的PGIP基因序列同源性为99%。该序列翻译后得到的氨基酸序列与NCBI上公布的油菜PGIP序列同源性为99%。该蛋白质序列中包含 8个亮氨酸重复区 （leucine-rich repeat，LRR） 。过去研究结果显示芥菜型油菜比甘蓝型、白菜型油菜对菌核病的抗性普遍较高，但是未能搞清楚具体的原因，只是提出抗菌核病基因主要分布在芥菜型油菜中，其次是甘蓝型油菜中。通过研究证实了芥菜型油菜上PGIP基因具有保守性、疏水性，而且结构稳定，具有多个信号肽，能够高效地发挥其抗核盘菌的功能。今后在油菜育种上应利用芥菜型油菜的优势，发挥其抗病育种的潜力。

关键词 芥菜型油菜； PGIP基因； 基因克隆； 生物信息学

中图分类号： S435.654

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017204

Abstract The best way to prevent Sclerotinia is to cultivate varieties against Sclerotinia. PGIP is an important anti-Sclerotinia protein. The full-length of PGIP CDS （1 048 bp） was cloned from Brassica juncea No. 6 in Tibet based on sequence homology， showing 99% similarity with PGIP from B.napus. The protein sequence contained 8 LRRs （leucine-rich repeats）. Previous studies showed that B.juncea had higher resistance to S. sclerotiorum than B.napus and B.campestris， but the underlying mechanism was unknown， though it was known that S.sclerotiorum genes were mainly distributed in B.juncea. The PGIP gene in B.juncea is conservative， hydrophobic， and stable in structure with several signal peptides， which has the potential for resistance to S. sclerotiorum and disease resistance breeding.

Key words Brassica juncea； PGIP gene； gene cloning； bioinformatics

油菜是我国最主要的油料作物，油菜菌核病是危害我国油菜生产的常见病害，对油菜的产量和品质造成严重的影响，选育抗菌核病油菜品种是防控菌核病最经济有效的途径。油菜菌核病的病原菌为核盘菌Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary，该菌分泌产生的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase， PG）可降解植物细胞壁，参与多个植物致病信号的传递，是病原真菌重要的致病因子[1]。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhibiting proteins，PGIPs）是一种植物细胞壁糖蛋白，它能抑制真菌所分泌的PG水解植物细胞壁的活性，并在植物体内积累能激活多种防御反应，从而抑制真菌的侵染[24]。此外，PGIP与PG的相互作用使植物细胞壁形成有生物活性的寡聚半乳糖醛酸（oligogalacturonide，OG），能有效地激活植物体内的防御系统，从而诱导植物的抗病性响应，使植物获得系统抗病性[2，56]，维护了植物细胞的完整性，使病原真菌可利用的营养物质减少，减缓了真菌生长繁殖速度[7]。芥菜型油菜 Brassica juncea L. 是中国重要的油料作物之一，在我国西部地区广泛种植，芥菜型油菜具有耐热、耐贫瘠、抗旱等特点[8]。目前甘蓝型油菜PGIP基因的研究较多[1，910]，但是芥菜型油菜PGIP基因的研究还未见报道，本研究目的是通过对菌核病有一定抗性的芥菜型油菜PGIP基因進行克隆和生物学分析，为油菜抗菌核病育种提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 植物材料

材料选择在大田种植对菌核病表现有抗性的芥菜型油菜‘藏油6号。

1.2 仪器与试剂

S1000 Thermal Cycler PCR扩增仪、台式冷冻离心机、SIGMA1-14小型离心机、琼脂糖凝胶成像系统、高压灭菌锅、恒温水浴锅、超净工作台、摇床，北京六一电泳槽、电泳仪。TaKaRa ExTaqDNA聚合酶、10×Ex Taq Buffer （20 mmol/L Mg2+ plus）、dNTP Mixture （各2.5 mmol/L）、TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA提取试剂盒、TaKaRa 凝胶回收试剂盒、TaKaRa AgaroseD-5琼脂糖凝胶、100 bp DNA Ladder （Dye Plus）、GoldView核酸染料、酵母提取物、TaKaRa 6×Loading Buffer。有机试剂均为化学分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 油菜DNA的提取及PGIP基因的克隆

采用CTAB法提取油菜总DNA。根据NCBI上已经公布的油菜PGIP基因序列设计引物Pf/Pr，Pf：TCATCTCCCTAACCATAT，Pr：GTATTCG-TCCTTATTCTTC，引物由北京华大公司合成。Pf/Pr的目的片段长度为1 048 bp，编码全长的PGIP基因。以提取的油菜总DNA为模板进行PCR扩增。反应体系（25 μL）： ddH2O 16 μL；10×PCR Buffer （Mg2+ Plus）3 μL；dNTP（各2.5 mmol/L） 2 μL；上游和下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL；Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL；DNA Templet 2 μL。将PCR管内的反应液用枪头轻轻吹打混匀，用小型离心机瞬时离心1次，放置于PCR仪进行扩增，PCR反应参数：94℃预变性3 min；94℃ 变性30 s；55℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min；35次循环；72℃终末延伸10 min。通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并将剩余产物保存于4℃冰箱。

1.3.2 PCR产物的回收、测序、核酸序列分析及其蛋白结构分析和预测

回收1.3.1所得的PCR产物并送交华大基因公司进行测序。使用NCBI BLAST分析PCR产物序列的同源性、并对核酸序列进行结构功能上的分析，推导其氨基酸序列。使用软件DNAstar对其氨基酸序列进行分析，确定其分子量、等电点、各氨基酸在蛋白中的比例，以及各种极性氨基酸、带电氨基酸、疏水性氨基酸的组成。使用SignalP 4.1 Server对PGIP氨基酸序列进行信号肽分析。使用Protscale软件预测蛋白质分子的疏水性和亲水性。通过ProtComp Version9.0软件预测PGIP蛋白的亚细胞定位，使用在线分析软件SOPMA 和Swiss-Model分析预测蛋白的二、三级结构。

2 结果与分析

2.1 PCR结果分析与比对

以芥菜型油菜DNA作为PCR反应模板进行扩增，结果显示，引物Pf/Pr扩增出1 048 bp的目的条带（图1）。

2.2 BLAST分析结果

扩增得到1 048 bp长度的PGIP序列，将测序得到的核酸序列与NCBI数据库中登录号为EU142023.1的序列进行BLAST比对，同源性为99%。根据PCR产物推导出的氨基酸序列与NCBI上公布的甘蓝型油菜Brassica napus（NP_001303064）序列同源性为99%。

将该段序列与其他9种植物上的PGIP蛋白序列进行比对，结果显示与不同种属植物深山拟南芥Arabidopsis lyrata、醉蝶花Tarenaya hassleriana、山葵Eutrema salsugineum、棉花Gossypium、可可Theobroma cacao、李Prunus persica、萝卜Raphanus sativus、黄瓜属Cucumis和木薯Manihot esculenta的相似度分别为70%、67%、82%、63%、65%、62%、68%、60%、61%。由PCR产物推导出的该段氨基酸序列富含亮氨酸重复序列，PGIP的亮氨酸重复结构域（LRR）保守性很高，其除个别碱基替换、插入或缺失外，序列高度保守（图2）。用BLAST2GO对该段富含亮氨酸的序列进行功能分析（表1），结果表明，这段亮氨酸重复区包含酪氨酸激酶受体、细胞黏附分子，毒力因子和细胞外基质结合蛋白，表明该蛋白很可能参与了细胞的信号转导、细胞黏附、细胞膜通道、细胞凋亡、细胞免疫反应等多种生物功能。

2.3 软件DNAstar对PGIP蛋白氨基酸序列分析结果

扩增得到的PGIP基因编码的蛋白包含342个氨基酸（表2），其理论分子量为38.2 kDa，等电点为8.2。pH为7时，电荷为4.5，碱性氨基酸（KR）36个，占总分子量12.7%，占残基总数的10.53%。酸性氨基酸（DE）32个，占总分子量的9.91%，占氨基酸残基总数的9.36%，疏水氨基酸（AILFWV）119个，占总分子量的35.65%，占氨基酸残基总数34.8%，极性氨基酸（NCQSTY）108个，占总分子量的30.76%，占氨基酸残基总数的31.58%。其中亮氨酸的比例最高，占总分子量的16.25%，占氨基酸残基总数16.08%。氨基酸序列的理化性质分析表明，PGIP蛋白为稳定类蛋白。

2.4 SignalP 4.1 Server对PGIP氨基酸序列信号肽分析结果

信号肽一般位于蛋白质的N端，与蛋白的定位有关，有助于蛋白本身向细胞内特定区域移动，在蛋白质合成结束之前被切除，一般具有16～26个氨基酸残基，其中包括疏水核心区、信號肽的C端和N端。通过SignalP 4.1 Server分析表明，PGIP蛋白上有22个氨基酸属于信号肽。这些信号肽可以引导PGIP顺利的合成、加工、运输到特定位置行使功能[1112]。

2.5 PGIP蛋白的亲水性和疏水性分析

使用在线软件Protscale预测蛋白质分子的亲水性和疏水性（图4）[13]。通常根据蛋白平均疏水值（GRAVY）来计算蛋白的亲水性和疏水性。GRAVY值在3～-2之间，横坐标为蛋白质氨基酸残基的序号，纵坐标表示残基的疏水亲水的特性。若是正值表明此蛋白为疏水蛋白，且值越大越疏水，若是负值表明为亲水蛋白，值越大越亲水。从Protscale工具统计分析的结果，GRAVY值为+0.45（最小值： -2.127，最大值：3.027），说明蛋白具有较强的疏水性，且在N末端有一典型的疏水区域。疏水性在蛋白质的结构、构象及与其他蛋白质的相互作用等方面具有重要作用，并且被认为与蛋白质的功能性质密切相关。PGIP的疏水性与蛋白质间的相互作用、形成蛋白功能结构域、维持PGIP蛋白质三级结构及信号肽的组成有关。

2.6 PGIP蛋白亚细胞定位

通过ProtComp Version9.0软件预测PGIP蛋白的亚细胞定位，4种预测方法（LocDB、NEuralNes、Pentames、Integral）权重值最高值均显示是胞外，由此将此蛋白定位于胞外，说明该蛋白是由细胞分泌到胞外并与PG结合，保护植物细胞壁不被降解（表3）。

2.7 PGIP蛋白二、三级结构分析

使用软件SOPMA对其二级结构进行分析[14]。结果显示PGIP氨基酸序列显示在二级结构中主要由29.53%的α螺旋22.8%的延伸链区和41.8%的无规则卷曲构成，凸面结构主要是无规则卷曲，第90个氨基酸出现“LxxLxxLxLxxLxxL”对称序列（图5），芥菜型油菜PGIP具有8个亮氨酸重复序列（图6），LRR被认为是参与了PG蛋白质与PGIP蛋白相互识别和相互作用的区域[1516]。这样的序列保证了芥菜型油菜PGIP的功能，使其在与PG互作时能保持较高的活性和稳定性。使用Swiss-Model预测蛋白三级结构，三级结构是由α螺旋和延伸链通过Loop环连接形成一个马蹄形分子（图7）。

蛋白质氨基酸序列中，半胱氨酸残基对蛋白质二、三级结构的形成起着重要的作用，几乎所有蛋白质中都存在着半胱氨酸。位于同一蛋白质链或者不同蛋白质链的两个半胱氨酸通过共价关联形成二硫键。二硫键对维持蛋白质的正确折叠、维持结构稳定与生物活性具有重要作用。二硫键的形成可导致同一或不同肽链的不同区域的氨基酸残基靠拢集合在一起，由此肽链进行折叠并形成稳定的空间拓扑结构，具有疏水性的氨基酸残基围绕着二硫键形成局部的疏水中心，通过防止水分子的进入来保护氢键[17]，从而有利于形成稳定的蛋白质高级结构区域。在芥菜型油菜PGIP的氨基酸序列中，在N端55、56氨基酸位置和C端的317、319氨基酸位置各有2个半胱氨酸，它们之间形成二硫键的可能性较大。因为有这样的稳定结构使得芥菜型油菜上的PGIP能稳定发挥其功能作用。

3 结论与讨论

过去研究结果显示芥菜型油菜比甘蓝型、白菜型油菜对菌核病的抗性普遍较高，但是未能搞清楚具体的原因，只是推测抗菌核病基因主要分布在芥菜型油菜和甘蓝型油菜中[1819]。而PGIP在油菜抵抗菌核病过程中发挥了重要的作用。本文第一次在芥菜型油菜cDNA中克隆得到PGIP的完整氨基酸编码区序列。从生物信息学角度，以芥菜型油菜为主要分析对象对其PGIP基因的核苷酸及氨基酸序列的构成、结构特点、生物学功能、生化特性、二、三级结构进行预测和分析。PGIP蛋白结构具有典型的亮氨酸重复序列（LRR）结构，在多种不同种属的植物上都能找到這段蛋白质序列，并且具有保守性，说明这段序列在植物进化中或许扮演了非常重要的角色。通过分析，其在植物的防御系统中起着重要作用，能够识别外源分子、转导信号引起植物体作出免疫反应。对PGIP进行亚细胞定位结果表明 PGIP定位于胞质外，其具有多个信号肽也印证了它具有的功能。芥菜型油菜上PGIP蛋白具有保守性、疏水性、而且结构稳定、具有多个信号肽，能够高效地发挥其功能。同时有研究报道PGIP提取物除了对核盘菌有抑制作用，对小麦禾谷镰刀菌Fusarium graminearum、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryzae均有抑制作用[20]，由此可见PGIP蛋白对病原真菌可能具有广谱抗性。今后在抗菌核病的油菜新品种培育上应该多利用芥菜型油菜PGIP基因的优势，发挥其抗病育种上的潜力。

参考文献

[1] 彭琦，陈松，张维，等.甘蓝型油菜PGIP基因家族新成员PGIP18的克隆及序列分析[J].分子植物育种，2014，12（4）：687693.

[2] 陈瑞，李金晶，关瑞攀，等.三七多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及表达分析[J]. 中草药，2016（24）：44204427.

[3] 周立. 小麦多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白对几种病原真菌抑制作用的研究[J]. 植物病理学报， 1998，28（2）：107112.

[4] DOVIDIO R， MATTEI B， ROBERTI S， et al. Polygalacturonases， polygalacturonase-inhibiting proteins and pectic oligomers in plant-pathogen interactions[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2004，1696（2）：237244.

[5] JUGE N. Plant protein inhibitors of cell wall degrading enzymes [J]. Trends in Plant Science， 2006， 11（7）：359.

[6] 朱佩佩，李艳梅，侯泳志，等.基于PGIP基因的蔷薇科植物分子进化树构建与分析[J].湖北农业科学，2016，55（21）：56725676.

[7] DE LORENZO G， DOVIDIO R， CERVONE F. The role of polygalacturonase-inhibiting proteins （PGIPs） in defense against pathogenic fungi [J].Annual Review of Phytopathology，2001， 39： 313335.

[8] 刘淑艳，刘忠松，官春云，等. 芥菜型油菜种质资源研究进展[J].植物遗传资源学报，2007，8 （3）： 351358.

[9] 皇甫海燕. 甘蓝型油菜PGIP2的原核表达、蛋白功能及其遗传转化的研究[D].长沙：湖南农业大学，2011.

[10]马田田. 甘蓝型油菜抗菌核病QTL定位及相关基因表达分析[D].南京：南京农业大学，2012.

[11]彭佳师，龚继明.信号肽与蛋白质的分选转运[J].植物生理学报，2011，47（1）：917.

[12]DYRLOV B J， NIELSEN H H G， BRUNAK S. Improved prediction of signal peptides： SignalP 3.0 [J]. Journal of Molecular Biology， 2004， 340（4）：783795.

[13]董嬌，周军， 辛培尧，等. 不同植物LDOX/ANS 基因的生物信息学分析[J]. 基因组学与应用生物学，2010，29（5）： 815822.

[14]GEOURJON C， DELEAGE G.SOPMA： Significant improvement in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments [J].Bioinformatics，1995，11（6）：681684.

[15]SHANMUGAM V. Role of extracytoplasmic leucine rich repeat proteins in plant defence mechanisms [J]. Microbiological Research， 2005， 160（1）：8394.

[16]KAJAVA A V， VASSART G， WODAK S J. Modeling of the three-dimensional structure of proteins with the typical leucine-rich repeats [J]. Structure， 1995， 3（9）：867.

[17]刘坤. 基于蛋白质序列信息预测二硫键的新方法研究[D].南京：南京理工大学，2017.

[18]王璐璐. 贵州地方油菜种质资源菌核病的抗性鉴定与评价[J]. 贵州农业科学，2014，42（4）：4246.

[19]晏立英，周乐聪，谈宇俊，等. 油菜菌核病拮抗细菌的筛选和高效菌株的鉴定[J]. 中国油料作物学报，2005，27（2）：5557.

[20]GOMATHI V， GNANAMANICKAM S S. Polygalacturonase-inhibiting proteins in plant defence [J].Current Science， 2004， 87（9）：12111217.

（责任编辑：田 喆）