引起小菜蛾盘绒茧蜂雌雄差异反应的气味筛选及行为学检测

朱云 刘杨 王桂荣 杨斌

摘要 小菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis是小菜蛾Plutella xylostella幼虫期重要的单性内寄生蜂，在小菜蛾的生物防治上具有广阔的应用前景。寄主植物受到小菜蛾为害后释放的挥发物的种类和释放量会变化，这在小菜蛾盘绒茧蜂搜寻小菜蛾过程中也起到了非常重要的作用。然而，这些寄主植物挥发物对小菜蛾盘绒茧蜂的吸引作用是否存在雌雄差异并不明确。本研究选取了32种十字花科蔬菜受小菜蛾为害后发生变化的气味以及小菜蛾幼虫粪便气味和小菜蛾的性信息素，通过EAG测定了小菜蛾盘绒茧蜂对各种气味物质不同浓度（100、10、1 μg/μL）的反应。结果显示，小菜蛾盘绒茧蜂对（E）4，8二甲基1，3，7壬三烯（DMNT）、苯乙腈、（R）（+）柠檬烯、正庚醛4种气味分别在100、100、1 μg/μL 和1 μg/μL的浓度下存在显著雌雄差异。进一步通过“Y”形嗅觉仪对这4种气味进行行为学检验，其中DMNT、（R）（+）柠檬烯和正庚醛分别在浓度为10、10 μg/μL和0.1 μg/μL时可以引起显著的雌雄行为差异。

关键词 小菜蛾盘绒茧蜂； 触角电位； 寄生； 植物挥发物； 嗅觉

中图分类号： S 476.3

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017162

Abstract Cotesia vestalis （Hymenoptera： Braconidae） is an important parasitoid wasp for the larvae of Plutella xylostella， and represents an effective natural enemy for biological control. Damage induced by herbivores alter the profile of plant volatiles that can attract the parasitoid wasp. However， so far it was unclear whether males and females are equally attracted by these odorants. In this study， 32 herbivoreinduced plant volatiles， 3 sex pheromone of P.xylostella and 2 larval frass volatiles in different concentrations were used to record electroantennograms （EAG） and observe behavior from both sexes of C.vestalis. Different responses were observed between sexes with （E）4， 8dimethyl1， 3， 7nonatriene （DMNT）， benzyl cyanide， （R）（+）limonene and nheptanal， used at the concentrations of 100 μg/μL， 100 μg/μL， 1 μg/μL and 1 μg/μL， respectively. Ytube behavior tests performed with these four odorants revealed significant difference between males and females for DMNT， （R）（+）limonene and nheptanal， at the concentrations of 10 μg/μL， 10 μg/μL and 0.1 μg/μL， respectively.

Key words Cotesia vestalis； electroantennogram； parasitism； plant volatile； olfactory

小菜蛾Plutella xylostella隸属于鳞翅目Lepidoptera，菜蛾科Plutellidae，是十字花科蔬菜的世界性害虫[1]；主要为害十字花科的甘蓝、紫甘蓝、花椰菜、芥菜、白菜、萝卜、油菜等40多种作物，造成巨大的经济损失[2]。对小菜蛾的防治以化学防治为主，但大量使用杀虫剂使小菜蛾产生了极强的抗药性，因此综合使用其他防治手段在小菜蛾的防治中具有迫切的需求。小菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis是小菜蛾幼虫期一种重要的单性内寄生蜂[34]，主要寄生2、3龄幼虫[5]，造成小菜蛾发育迟缓甚至停滞，是生物防治小菜蛾的重要天敌资源。

天敌寄生蜂对害虫的定位是通过嗅觉系统完成的[6]。植物受到植食性昆虫为害后可以产生一些能够吸引天敌的植物挥发物[710]。其中，十字花科蔬菜被小菜蛾取食后释放的一系列挥发物可以吸引小菜蛾盘绒茧蜂等多种寄生蜂寄生小菜蛾[3]。通过GCMS对白菜、甘蓝、芥蓝、菜心等十字花科蔬菜受到小菜蛾幼虫为害前后气味物质的种类和释放量进行差异分析，发现差异变化多为释放量不同，主要包括顺3己烯1醇、（R）（+）柠檬烯、α蒎烯、反2己烯醛、（E）4，8二甲基1，3，7壬三烯（DMNT）等37种挥发物[3]。其中，壬醛、苯甲醛、α葎草烯、反式β罗勒烯、樟脑、辛醛、己醛对中红侧沟茧蜂Microplitis mediator有强烈的吸引作用[1113]；金合欢烯可以吸引红足侧沟茧蜂M.croceipes[14]；乙酸香叶酯可以同时吸引三种寄生蜂：缘腹盘绒茧蜂Cotesia marginiventris、黑唇姬蜂Cylloceria melancholica、红腹侧沟茧蜂Microplitis rufiventris；缘腹盘绒茧蜂对橙花叔醇则显示出极强电生理反应[15]；桉叶油素在粉蝶盘绒茧蜂Cotesia glomerata的远距离定向过程中起重要作用[16]；DMNT和4，8，12三甲基1，3，7，11十三碳四烯（TMTT）是虫害诱导后产生的主要萜烯类化合物，能够吸引多种寄生蜂[17]，并帮助天敌识别被植食性害虫为害过的植株[18]。小菜蛾盘绒茧蜂通过识别这些化合物，定位被小菜蛾为害的植物，进而对小菜蛾进行定位[13， 1921]。其中，反2己烯醛、顺3己烯1醇、柠檬烯、苯甲醇、正庚醛、顺3己烯基乙酸酯、乙酸己酯、茉莉酮酸甲酯、香芹酮、苯乙腈、柠檬烯、α蒎烯、β紫罗兰酮均对小菜蛾盘绒茧蜂有吸引作用[2224]。香桧烯在卷心菜受到小菜蛾幼虫为害后释放量显著变化，也可能与小菜蛾盘绒茧蜂的寄主识别有关[21]。

小菜蛾的性信息素和幼虫粪便挥发物在小菜蛾盘绒茧蜂的寄主定位过程中也发挥着非常重要的作用[3，25]。小菜蛾性信息素主要成分Z1116：Ald、Z1116：Ac和Z1116：OH对小菜蛾盘绒茧蜂有显著的吸引作用，与植物挥发物混合后吸引效果显著提高[3]。从小菜蛾幼虫粪便中提取到的二甲基三硫醚、异硫氰酸烯丙酯对小菜蛾盘绒茧蜂也有显著的吸引作用[3]。

小菜蛾盘绒茧蜂通过识别小菜蛾以及受小菜蛾为害的寄主植物气味定位小菜蛾幼虫，将卵产于小菜蛾幼虫体内，完成寄生过程[5]。小菜蛾盘绒茧蜂雌虫慢慢盘旋着靠近被小菜蛾取食为害的十字花科蔬菜，当距离2～3 cm时，触角以及翅膀的抖动频率加大，腹部朝向小菜蛾为害位点弯曲探寻小菜蛾[2627]；小菜蛾盘绒茧蜂触角的超微结构研究表明，雌虫的嗅觉感器数量高于雄虫，并且钟形嗅觉感器和坛形嗅觉感器只存在于雌虫触角上[28]。以上特性表明小菜蛾盘绒茧蜂雌雄间应该对不同气味刺激的反应存在差异，但以往的研究并没有严格区分性别[24]。本研究选取了包含寄主植物被小菜蛾取食后产生应激变化的37种气味物质，通过触角电位试验筛选了能够引起小菜蛾盘绒茧蜂雌雄间电生理差异的气味物质，并对筛选到的气味物质进行了行为学验证，为阐明小菜蛾盘绒茧蜂交配及产卵的嗅觉机制提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试昆虫

小菜蛾于2016年6月采自北京近郊区的蔬菜田，在温度（25±1）℃，相对湿度60%左右，光周期为L∥D=14 h∥10 h的条件下进行实验室人工饲养10代。小菜蛾幼虫饲养于装有新鲜结球白菜的塑料盒内直至化蛹，将蛹收集并置于挂满新鲜甘蓝叶片的养虫笼（45 cm×45 cm×45 cm）内等待羽化、交配及产卵。将被产卵的甘蓝叶片回收后，放入装有新鲜结球白菜的塑料盒内继续饲养。

小菜蛾盘绒茧蜂的茧于2016年8月份来自浙江大学昆虫科学研究所陈学新实验室，在温度（25±1）℃，相对湿度60%左右，光周期为L∥D=14 h∥10 h，光照强度1 000～1 500 lx的条件下进行实验室人工饲养。成蜂羽化后饲喂10%的蜂蜜水，约2～3 d后将交配过的10头雌虫放入装有120头小菜蛾2、3龄幼虫的养虫盒内寄生4 h，随后把被寄生的小菜蛾幼蟲放入装有新鲜结球白菜的塑料盒内饲养。8 d以后收集寄生蜂的茧，取羽化后2～5 d的成蜂用于EAG和行为学检测。

1.2 供试试剂

试验中所用到的标准化合物来源和纯度见表1，除苯乙腈不溶于正己烷，以二氯甲烷作溶剂外，其余化合物均以正己烷作溶剂，定容至100 μg/μL，保存于-20℃。

1.3 触角电位（EAG）的测定

玻璃电极与触角的准备：使用电极拉针仪P1000/G1276（Sutter Instrument，USA）制备玻璃电极，切去尖端至内径可容纳触角，吸入离尖端10～15 mm的0.1 mol/L的KCl电极缓冲液。将羽化后3 d的小菜蛾盘绒茧蜂的头部切下，一根触角切除尖端，插入玻璃电极，去除另一根触角，将参比电极插入头部，接通电极进行记录[2930]。

化合物的配制：将苯乙腈溶于二氯甲烷，其余化合物溶于正己烷，配制梯度浓度为100、10、1 μg/μL的样品。以溶剂为阴性对照，以顺3己烯醇为内参，每次取10 μL滴在1 cm×5 cm折成“V”形的滤纸条上，插入巴斯德进样管，用以检测各气味的EAG反应值[13，24]。每根触角的气味刺激顺序为对照、内参、样品，每个化合物做5次生物学重复。设置直流电压2 mV，连续气流流速为500 mL/min，刺激流速为500 mL/min，刺激时间为0.5 s，两次刺激间隔为40 s。记录到的数据通过以下公式换算：R=（挥发物反应值―对照反应值）/（内参反应值―对照反应值），计算供试化合物的EAG相对反应值R。采用单因素方差分析法（Graph Pad Prism 与SPSS 18.0）分析雌雄间EAG反应值差异。

1.4 行为测定

采用“Y”形嗅觉仪对EAG结果中存在雌雄差异的化合物进行行为学验证。“Y”形嗅觉仪基部长15 cm，两臂长25 cm，夹角60°，内径3 cm，放置在暗箱内（100 cm×80 cm×80 cm），暗箱底部以日光灯补充光照，室内温度保持在（25±1）℃，流量计流速为500 mL/min。样品和样品溶剂（空白对照）分别放入“Y”形嗅觉仪两臂，将羽化3 d的小菜蛾盘绒茧蜂放入端部5 cm处开始计时，当小菜蛾盘绒茧蜂越过A臂或B臂1/2处且停留5 s以上时，视为做出选择；10 min后无明显趋向，则视为无选择[31]。每组处理测试雌、雄虫各30头，每头小菜蛾盘绒茧蜂只测试一次，每测试5头将A、B两臂互换位置，10头后更换新的“Y”形嗅觉仪，更换后的“Y”形嗅觉仪以无水乙醇清洗干净，晾干后可重复使用。各化合物的测试浓度梯度为100、10、1、0.1和0.01 μg/μL[13]，每个浓度重复3次。运用Graph Pad Prism与SPSS 18.0软件，采用卡方检验计算显著性水平P值[24]。

2 结果与分析

2.1 小菜蛾盘绒茧蜂雌、雄触角对37种化合物的EAG反应

本研究测定了梯度浓度下小菜蛾盘绒茧蜂雌、雄触角对37种化合物的EAG反应（表2）。结果表明，浓度为100 μg/μL 时，雌虫对辛醛（编号23，以下各成分括号内数字为表2中的编号）的反应值最大，雄虫对壬醛（22）的反应值最大；浓度为10 μg/μL时，雌、雄虫均对壬醛（22）的反应值最大；浓度为1 μg/μL时，雌虫对壬醛（22）的反应值最大，雄虫对辛醛（23）的反应值最大；在DMNT（17）100 μg/μL、苯乙腈（27）100 μg/μL、（R）（+）柠檬烯（9）1 μg/μL、正庚醛（21）1 μg/μL这4个条件下雌雄间触角电位反应值有显著差异，有趣的是，这4种化合物引起的触角电位值均为雄虫显著高于雌虫。

2.2 小菜蛾盘绒茧蜂雌、雄虫对4种差异化合物的行为学检测

通过触角电位试验筛选到4种引起雌雄间电生理有显著差异的气味成分DMNT（17）、苯乙腈（27）、（R）（+）柠檬烯（9）和正庚醛（21），测定小菜蛾盘绒茧蜂对这4种成分的行为学反应。结果显示，小菜蛾盘绒茧蜂雌雄虫对不同化合物表现出了不同的趋向性，基本表现为高浓度驱避，低浓度吸引，但雌雄最适的吸引浓度不同。当DMNT浓度为100 μg/μL时，对雌雄均有显著的驱避作用（χ2=33.120，df=1，P<0.000 1和χ2=22.327，df=1，P< 0.000 1）；浓度为0.1 μg/μL对雌虫有显著的吸引作用（χ2=7.916，df=1，P=0.009）（图1a～b）；浓度为0.1 μg/μL时雌雄间行为差异显著 （χ2=3.037，df=1，P=0.041），对雌虫有更强的吸引作用（图1c）。当苯乙腈浓度为100 μg/μL时，对雌虫的驱避效果显著，但对雄虫并不明显 （χ2=6.542，df=1，P=0.014）；当浓度降低至1 μg/μL和0.1 μg/μL时，对雄虫有显著的吸引作用（χ2=9.304，df=1，P=0.004和χ2=6.852，df=1，P=0.014）（图2a～b）；雌雄虫对苯乙腈的趋向性无显著差异（图2c）。当（R）（+）柠檬烯浓度为100 μg/μL时对雌虫有显著的驱避作用（χ2=9.304，df=1，P=0.004），但浓度降低至10 μg/μL时变为对雌虫有显著的吸引作用（χ2=6.161，df=1，P=0.013）；在浓度为1 μg/μL时对雄虫有显著的吸引作用（χ2=424，df=1，P=0.044）（图3 a～b）；浓度为10 μg/μL时雌雄间反应差异显著（χ2=5.733，df=1，P=0.017），对雌虫有更强的吸引作用（图3c）。正庚醛在浓度为100 μg/μL和10 μg/μL时对雌雄均有驱避作用（χ2=24.554，df=1，P=0.000；χ2=12.343，df=1，P=0.001），浓度为100 μg/μL时对雄虫的驱避作用显著（χ2=10.612，df=1，P=0.002）。浓度为1 μg/μL和0.1 μg/μL时对雌蟲的吸引作用显著（χ2=11.679，df=1，P=0.001和χ2=8.283，df=1，P=0.005）（图4 a～b）；在浓度为10 μg/μL时对雄虫有更强的吸引作用，尽管差异并不显著（χ2=5.551，df=1，P=0.018），但在浓度为0.1 μg/μL时对雌虫有显著的吸引作用（χ2=5.048，df=1，P=0.025）（图4c）。

3 讨论

本研究选取了37种气味物质，包括十字花科蔬菜受小菜蛾为害后发生变化的气味、小菜蛾幼虫粪便气味和小菜蛾的性信息素，测定了小菜蛾盘绒茧蜂对这些气味不同浓度下EAG反应值。结果显示，33种化合物均未表现出明显的性别差异，这一结果在红足侧沟茧蜂和绿盲蝽等其他植食性昆虫中也有报道[11，3134]，说明小菜蛾盘绒茧蜂雌、雄成虫使用相同的化合物来搜寻寄主[13]。其中小菜蛾盘绒茧蜂雌雄均对辛醛和壬醛有较大的EAG反应。这两种气味是常见的绿叶气味，是十字花科蔬菜受到小菜蛾幼虫为害后大量释放的气味，对腰带长体茧蜂雌雄虫、中红侧沟茧蜂、草间小黑蛛、南方小花蝽均有显著的吸引作用[12，20，24]。

DMNT、苯乙腈、（R）（+）柠檬烯和正庚醛也属于常见的绿叶气味物质，在十字花科蔬菜中广泛存在并对它们的生长发育起到重要作用。研究结果表明这4种化合物能引起雌雄虫触角电位的差异，但与预想不同的是，4种气味的EAG值均为雄虫高于雌虫，说明雄虫在寻找配偶的过程中也需要植物源气味，并且可能需要更高的响应值来辅助定位雌性。但在行为学检验中，这几种气味并没有引起雄性显著高于雌性的行为趋性，尽管在低浓度苯乙腈的刺激下雄性的选择趋性略高于雌性。另外3种化合物DMNT、（R）（+）柠檬烯和正庚醛可以引起小菜蛾盘绒茧蜂雌雄趋向性的显著差异，雌虫显著高于雄虫。其中，DMNT是虫害诱导后产生的主要萜烯类化合物，已被报道可以吸引多种寄生蜂[17]，例如水稻在受到二化螟为害后，DMNT释放量增加，能够吸引更多的二化螟绒茧蜂，提高对二化螟的寄生率，从而达到自我防御的目的[35]。（R）（+）柠檬烯也是虫害诱导后产生的主要萜烯类化合物，可单独或与其他单萜类化合物混合用于针叶树大小蠹的寄生蜂诱引[22]，它对菜粉蝶盘绒茧蜂雌虫也有较为显著的吸引反应。在双翅目昆虫橘小实蝇中，交配后的雌虫对（R）（+）柠檬烯的趋向反应要显著高于雄虫，可能与产卵行为密切相关[3637]。正庚醛也是常见的绿叶气味，对腰带长体茧蜂雌虫有明显的吸引作用，并且对半翅目昆虫骚扰锥蝽雌虫的吸引作用要显著高于雄虫[6]。

尽管这4种气味的EAG与行为学的结果并不是十分吻合，但可以推断这4种气味在小菜蛾盘绒茧蜂雌雄虫定位寄主或配偶的过程中具有重要的作用，具体的机制还有待于进一步的深入研究。此外，本研究为针对小菜蛾盘绒茧蜂不同性别开发特异性引诱剂或驱避剂提供了理论依据。

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（责任编辑：田 喆）