陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测

王志荣 李晓东 朱玉 黄泽军 高建昌 国艳梅 杜永臣 王孝宣

摘要 近年来在陕西番茄生产区出现了一种新病害，病株表现为叶片褪绿，叶脉颜色变深及叶片增厚，果实变小发白，严重影响番茄产量及经济效益，2016年发病极为严重，部分产区甚至绝收。该病疑似由番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）引起。利用ToCV特异引物对感病番茄样品进行RT-PCR检测，结果从所采集的4份病样中均检测到ToCV预期大小的特异片段。对ToCV外壳蛋白CP基因和类热激蛋白HSP70h基因进行克隆与序列分析，ToCV-YL1 CP基因774个核苷酸序列与已报道的ToCV CP基因有较高的一致性，与山东青岛和山西晋中分离物同源性为100%。ToCV-YL1 HSP70h基因1 665个核苷酸序列与已报道的ToCV HSP70h基因有较高的同源性，与中国、韩国、日本、美国、希腊分离物同源性达到99%以上。研究表明ToCV已传播至陕西地区。

关键词 番茄； 番茄褪绿病毒病； CP基因； HSP70h基因

中图分类号： S 436.41

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017240

Abstract In recent years， a new disease on tomato has occurred in tomato production area of Shaanxi Province. The diseased tomato plants showed chlorotic leaves， dark greening veins and leaf thickening occurred in the diseased tomato plants， and the fruits became partial white and small， which seriously affected the yield and economic benefits. The disease is extremely serious， leading to total yield loss in part of the producing areas in 2016. The symptom of infected tomatoes is similar to Tomato chlorosis virus （ToCV）. The expected DNA fragments were amplified from all 4 infected samples with specific markers of ToCV by RT-PCR. The coat protein gene （CP） and heat shock protein 70 （HSP70h） gene of ToCV were cloned and analyzed， respectively. The nucleotide sequence of the CP gene of ToCV-YL1 was the same as those of the previously reported ToCV isolates in Qingdao and Jinzhong. The nucleotide sequence of the HSP70h gene of ToCV-YL1 shared the highest identity （up to 99%） with those of the ToCV isolates from China， South Korea， Japan， USA and Greece. These results confirmed that ToCV had spread to Shaanxi.

Key words tomato； Tomato chlorosis virus； CP； HSP70h

番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）属于长线形病毒科Closteroviridae毛形病毒属Crinivirus。ToCV基因组含有两条正义单链RNA，是一种RNA病毒，其中RNA1有8 594个核苷酸，RNA2有8 242个核苷酸。ToCV是韧皮部病毒不能通过机械摩擦接种传播[12]。在自然条件下，ToCV只能依靠媒介昆虫烟粉虱传播[3]，B型烟粉虱Bemisia tabaci biotype B、Q型烟粉虱B.tabaci biotype Q、A型烟粉虱B.tabaci biotype A、温室白粉虱Trialeurodes vaporariorum、银叶粉虱B.argentifolii和纹翅粉虱T.abutilonea等介体均可传播ToCV[4]，该病毒是唯一能通过4种分属于两个属的粉虱传播的病毒[56]。ToCV寄主范围广泛，可以侵染茄科Solanaceae、菊科Compositae、藜科Chenopodiaceae、苋科Amaranthaceae、番杏科Aizoaceae、夹竹桃科Apocynaceae及白花丹科Plumbaginaceae等7科25种植物。其中，茄科寄主数最多，如番茄Solanum lycopersicum、辣椒Capsicum annuum[78]、马铃薯Solanum tuberosum[4]、普通烟Nicotiana tabacum、本生烟N. benthamiana等多种烟草[910]。

番茄褪綠病毒病最早于1989年在美国佛罗里达州温室栽培番茄上出现，1998年在美国佛罗里达州该病原首次被鉴定为番茄褪绿病毒ToCV[1]。该病毒现已蔓延至世界各地，可危害多种作物[4，8，1112]，在北美洲、南美洲、欧洲、非洲和亚洲[1317]均有报道。我国最早于2004年在台湾地区发现ToCV[14]，2013年后在北京、江苏、山东、河北、天津、河南、辽宁、广东等地区陆续有关于ToCV的报道[1823]。2016年在陕西杨凌番茄主产区发现番茄疑似感染ToCV，感病面积较大，表现为番茄整株褪绿黄化，果实变小发白，严重影响番茄生长并造成很大经济损失，部分产区绝收。本研究对采集的感病番茄样品进行了分子检测与鉴定，并对ToCV外壳蛋白CP基因和类热激蛋白HSP70h基因进行克隆与序列分析，以探讨引起该病害的原因，并对其进行有效防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集

2016年11月在陕西省杨凌番茄生产区的感病区采集4份感病番茄材料叶片，编号为ToCV-YL1～ToCV-YL4，同时采集该生产区非感病区健康番茄叶片作为对照。

1.1.2 生化试剂和菌株、载体

RNA提取试剂盒EasyPure Plant RNA Kit、反转录试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、FastPfu DNA聚合酶、凝胶回收试剂盒EasyPureQuick Gel Extraction Kit、克隆载体pEASY-Blunt Zero Clonging Kit、Trans1-T1感受态细胞均由北京全式金生物技术有限公司提供。分子量标准DNA Marker IV由天根生化科技有限公司提供，2×DNA Taq PCR Mix由北京依联轩科技有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 番茄叶片总RNA的提取及检测

使用RNA提取试剂盒提取番茄叶片总RNA。取番茄编号为ToCV-YL1～ToCV-YL4和健康番茄样品的叶片0.1 g，依照试剂盒提取说明步骤提取总RNA，最终将RNA溶解于40.0 μL RNAse free-water中。保存于-80℃用于后续试验。以番茄叶片总RNA作为模板，使用反转录试剂盒反转录RNA合成cDNA。反应体系20.0 μL及具体试验步骤如下：RNA 5.0 μL，0.5 μg/μL Anchored Oligo（dT）18 Primer 1.0 μL，RNAse free-water 2.0 μL；65℃变性5 min，迅速冰浴2 min。再加2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScriptRT/RI Enzyme Mix 1.0 μL，gDNA Remover 1.0 μL，42℃孵育30 min，80℃加热5 min失活TransScriptRT与gDNA Remover。利用RT-PCR技术对番茄褪绿病毒进行检测，以cDNA为模板利用引物ToCV-F/R进行RT-PCR扩增。反应体系为：cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.2 μL，Mix 5.0 μL，灭菌水 3.6 μL，总体积为10.0 μL。PCR反应程序：预变性94℃ 4 min；变性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，32個循环；终延伸72℃ 5 min。PCR产物经3%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 ToCV特异引物设计

根据NCBI网站上已公布的北京分离物ToCV基因组序列设计了4对特异引物（表1）。ToCV-F/R是根据ToCV-BJ RNA1（登录号：KC887998）序列设计的特异引物，CP-1-F/R、HSP-2-F/R、HSP-3-F/R 是根据ToCV-BJ RNA2（登录号：KC887999）序列设计的特异引物。CP-1-F/R能扩增CP基因的774 bp序列，HSP-2-F/R、HSP-3-F/R扩增序列进行拼接得到1 665 bp的HSP70h基因序列。

1.2.3 ToCV的CP基因及HSP70h基因扩增、序列克隆及测序

RT-PCR扩增体系50.0 μL，包括cDNA 2.0 μL，2×TransStart FastPfu Mix 25.0 μL，上下游引物各1.0 μL，灭菌水21.0 μL。PCR反应程序：预变性95℃ 3 min；变性95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40个循环；终延伸72℃ 5 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶回收试剂盒回收目的谱带，回收产物克隆到Blunt Zero载体上。转化到大肠杆菌Trans1-T1，经验证每对引物均得到5个阳性克隆后，再分别选取3个阳性克隆送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

1.2.4 序列分析

将得到的CP基因序列和HSP70h基因序列在NCBI网站中进行分析比对，根据比对结果，再选取NCBI上已发表的ToCV分离物的CP基因完整序列51份和HSP70h基因完整序列42份（表2～3）。利用DNAStar中的DNAMAN软件对选定的序列进行同源性比对，利用Mega6.0软件的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法（neighbor-joining， NJ）构建系统进化树，系统进化树中各分支置信度（bootstrap）进行1 000次重复分析。

2 结果与分析

2.1 ToCV RT-PCR 检测结果

利用ToCV特异标记ToCV-F/R进行RT-PCR分析，4份感病番茄材料均能检测到与预期大小一致的239 bp特异片段，而健康番茄样品中未检测到目的片段（图1a），结果表明陕西杨凌出现的新病害为番茄褪绿病毒病。

2.2 ToCV CP基因序列分析

利用ToCV CP基因的特异引物CP-1-F/R进行RT-PCR分析，从感病材料中扩增出839 bp片段，利用NCBI网站中BLAST功能对所得分离物的扩增序列进行比对，扩增产物包括完整CP基因（774个核苷酸），与预期结果相符，初步证明陕西杨凌番茄新病害是由番茄褪绿病毒的危害所致。CP基因的3个阳性克隆测序结果一致。

将ToCV-YL1 CP基因全长774个核苷酸（GenBank登录号：MF346383）与在NCBI上收集的来自亚洲、欧洲、北美洲、南美洲的9个国家的51份ToCV CP基因序列进行同源性分析及进化树构建。结果表明ToCV-YL1 CP基因序列与山东青岛ToCV-SDQD（KT809400）和山西晋中ToCV-SXJZ（KX853540）序列同源性达到100%，与国内其他地区及日本、韩国、美国地区的同源性在99%以上，而与希腊、巴西、以色列、西班牙等地样品基因序列同源性在97%～99%。这些结果表明，ToCV CP基因序列在不同地区存在一定差异，ToCV-YL1 CP基因与国内其他地区及亚洲地区CP基因具有较高同源性，相比之下，ToCV-YL1 CP基因与欧洲地区分离物CP基因同源性较低（表2）。

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（责任编辑：田 喆）