橡胶树速衰病的病原菌种类鉴定

蒋桂芝 陶建祥 刘一贤 施玉萍 蔡志英 李国华

摘要

橡胶树速衰病是云南植胶区近年发生的重要病害，引起橡胶树快速衰退后死亡。对云南主要植胶区进行速衰病调查采样及病原菌分离鉴定，根据病原菌的形态学、培养特征，以及ITS1/ITS4引物扩增获得ITS序列，鉴定其病原为可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae和茄镰孢Fusarium solani。

关键词

橡胶树； 速衰病； 病原菌； 可可毛色二孢； 茄镰孢

中图分类号：

S 432.44

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017349

Identification of the pathogen species causing quick decline

diseases of rubber tree

JIANG Guizhi1， TAO Jianxiang2， LIU Yixian1， SHI Yuping1， CAI Zhiying1， LI Guohua1

（1. Yunnan Institute of Tropical Crops， Jinghong 666100， China；

2. Yunnan Natural Rubber Industry Group Jiangcheng Co.，Ltd.， Puer 665907， China）

Abstract

Quick decline diseases， which can cause the quick decline and death of rubber tree， occurring seriously in rubber plantations of Yunnan in recent years. To find out the pathogens causing rapid decline of rubber tree， the pathogens were isolated and identified according to the morphological and phylogenetic analyses. The results confirmed that the pathogens were Lasiodiplodia theobromae and Fusarium solani.

Key words

rubber tree； quick decline disease； pathogen； Lasiodiplodia theobromae； Fusarium solani

橡膠树是我国热带地区重要的经济作物，根病是橡胶生产破坏性较大的病害之一。我国植胶区已发现红根病（red root rot）、褐根病（brown root rot）、紫根病（purple root rot）、臭根病（stinking root rot disease）、黑纹根病（double black lines root rot）、黑根病（black root fungus）、白根病（white root rot）等7种橡胶树根病，而以红根病、褐根病2种根病的经济地位最重要[1]。长期以来一直认为我国橡胶树死亡主要是由红根病、褐根病引起，防治研究也以红根病、褐根病为主。2016年4月在云南省景洪市的勐养农场和勐腊县的勐满农场进行橡胶树根病防治药剂试验，分别选择胶园中根病死亡旁边的植株为试验处理对象，雨季来临后的6月开始第1次施药，7月份第2次施药，在施药期间勐满农场有3个试验小区、勐养农场有2个试验小区分别出现试验植株突然死亡现象，其中勐满农场的1个试验小区试验植株施药后2个月内连续死亡3株，典型症状：叶片突然萎蔫似水烫过一样，2～3 d后叶片开始逐渐变成黄褐色、不脱落，树头变黑、坏死，一周后叶片干枯，逐渐脱落（图1a），发生严重的林段植株连续死亡形成病区。笔者对试验区内植株死亡原因进行调查：挖开树头周围的土，可看到树头已发生病变坏死，而树干正常，死亡的树一般是从树头、根部向茎干发展；经过调查，排除药害的可能性，确定植株为真菌感染造成死亡。2016年8月至2017年3月笔者在西双版纳州景洪市的勐养农场、普文镇，勐腊县的勐满农场、勐捧农场、勐醒农场，普洱地区的江城公司，红河州河口县的河口农场和金平农场等地的根病区进行调查，都有此类症状的死亡植株，严重的地方橡胶树大面积死亡（图1b），因发病突然、迅速死亡而命名为速衰病。调查发现速衰病树头坏死症状有2种，第一种是病变树头、根表面有黑色土样物质和凝胶（图1c），病根去皮层后可看到有黑色斑（图1d）；第二种是病变树头、根表面没有黑色土样物质（图1e），症状以第一种居多，占调查86.5%，第二种占13.5%。对各地进行了采样，现将速衰病病原菌的初步研究结果进行报道。

1 材料和方法

1.1 材料

病原分离材料、镜检材料来源于云南省植胶区，西双版纳州景洪市勐养农场、普文镇，勐腊县勐满农场、勐捧农场、勐醒农场；普洱地区的江城橡胶公司；红河州的河口农场和金平农场等8个单位胶园；采集时间：普文镇为2017年3月，其他为2016年8-9月。

1.1.1 病原分离材料

选择症状典型、近期刚死亡的橡胶树，用刀刮开感病橡胶树树头表层皮，取病、健交界处大小为（0.3～0.5）cm×（0.3～0.5）cm树皮组织作为病原分离标本，带回实验室进行病原分离。每单位一个胶园为1个样点，每个样点采3～4株，每株采样3个。

1.1.2 镜检材料

挖开感病死亡树与相邻健康树之间的表土，可以看到有互相交错的根，有些健康树朝向感病树方向生长的根已被感染，将已感病的根带回实验室保湿培养，用于镜检。

1.1.3 致病性试验材料

没有病斑的正常橡胶树老化叶片；在苗床上生长3～4个月的GT1实生苗；直径25～30 cm的花盆；河沙；橡胶木屑。

1.2 方法[2]

1.2.1 病原物分离及纯培养

将带回的标本放在0.1%的升汞液中浸泡30 s，取出用灭菌水清洗3次，每次1 min；将清洗好的材料用灭菌的滤纸吸去多余的水分，分别置于PDA平板培养基上，在25～28℃室温下培养，3～5 d后出现菌落，用灭菌针挑取少量菌丝移接到新的PDA平板上培养5～7 d，选取具有代表性的优势菌落进行单孢分离、培养，得到纯培养菌种用于致病力性测试。

1.2.2 致病性测试

1.2.2.1 离体叶片接种

将正常的橡胶功能叶片用自来水清洗叶片表面，晾干叶片表面的水分后待用；将培养5 d的菌种用接种针划成约0.5 cm×0.5 cm的菌块备用；在准备好的叶片主叶脉两边分别错位不对称滴上一滴灭菌水，用大头针在有水滴处扎3个小孔，小孔排列成三角形，然后将备好的菌块分别放到扎孔的水滴上，把菌块有菌丝的一面贴在叶面上，每片叶上接种2个菌块，每个菌接种3～4片叶，最后在叶片上做好标记，放入保湿缸内在25～28℃室温下保湿培养，3～5 d后取出观察接种感病情况。叶片感病后进行病原再分离，若分离得到与所接菌种一致，即可确认为有致病力，然后进行幼苗根部接种。

1.2.2.2 幼苗根部接种

菌种准备：将干橡胶木屑1 000 g、葡萄糖200 g、可溶性淀粉200 g、水1 500 mL均匀混合，分别放入300 mL三角瓶中，每瓶装100 g，放入高压灭菌锅中灭菌30 min，待瓶中的基质冷却至室温时，将准备好的菌株接种到基质上，在25～28℃室温下培养15～20 d，待菌丝长满基质后即作为盆栽接种的菌种。

基质：将干橡胶木屑1 000 g、葡萄糖200 g、可溶性淀粉200 g、水1 500 mL均匀混合后，放入高压灭菌锅中灭菌30 min，待基质冷却至室温待用。

盆栽接种：将2 000 g河沙+1 500 g灭菌的基质+100 g菌种（上述准备的）混合均匀后分别装入3个花盆中，每盆栽苗4株；对照为2 000 g河沙+1 500 g灭菌的基质，分别装入3个花盆中，每盆栽苗4株。处理和对照各栽3盆。苗栽好后放在阳台上，淋透水1次，此后每3～4 d浇水1次，气温18～30℃。栽苗后第3天开始观察，以后每隔1 d观察1次，观察时间至栽苗3个月。树苗出现感病后进行病原再分离，若分离得到与接种一致的菌株，即确认为橡胶树速衰病的病原菌，然后进行病原鉴定。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 形态鉴定

将经柯赫氏法则验证的菌株在25～30℃室温、PDA平板培养基上培养5～7 d，依据菌落形态、子座形态和分生孢子形态等进行鉴定。

1.3.2 分子鉴定

使用上海生工生化科技有限公司植物基因组试剂盒进行真菌DNA提取[3]，PCR扩增产物交由上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序。最后将该病菌的ITS序列在NCBI网站上进行同源性比较（BLAST），分析和确定其分类地位。

1.4 病根镜检

将1.2.2挖出的感病树根带回实验室，用自来水清洗干净表面的泥土，放在20～25℃、RH 70%～80%的室温下，待树根表层长出分生孢子后进行镜检。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离

8个采样点，共采到37株，101个样品。其中第一种症状（病变树头、根表面有黑色土样物质和凝胶）32株96个样品，占总采样量的86.5%；第二种症状（病变树头、根表面没有黑色土样物质）的5株15个样品，占总采样量的13.5%，其中金平农场1株、江城橡胶公司1株、普文农场2株、勐养农场1株。所有标本经表面消毒处理后，在PDA平板、25～30℃室温下培养。

第一种症状的样品培养2 d后，96个样品有92个形成白色菌落。5 d后，菌落变为灰黑色，得到90个纯菌落， 另2个菌落有杂菌。培养至30 d镜检，菌株产孢，孢子形态、大小一致，随后进行单孢分离、培养，得到纯培养菌株，选取一代表性菌株编号为XJ160830，用于致病力确定。

第二种症状的样品培养5 d，15个样品得到香槟色菌株12个，比率为80.0%，为优势菌株，经镜检12个菌株产孢，孢子形态、大小一致，确定为同一种菌，随后进行单孢分离、培养，得到纯培养菌株，选取一代表性菌株编号为XJ160901，用于致病力确定。

2.2 致病力测试

2.2.1 离体叶片接种

在25～28℃室温下，离体叶片分别接种2种菌株， 24 h后在接种点均形成明显的水渍状斑。

XJ160830接种48 h后病斑扩展直径达到2.0 cm左右（图2a），第3天进行病原菌再分离，在PDA平板、25～28℃室温下培养3 d后得到与接种一致的菌株，确认该菌对离体叶片有致病力，进行幼苗根部接种试验。

XJ160901菌种接种48 h后病斑扩展0.5 cm左右，第5天（图2b）进行病原菌再分离，在PDA平板、25～28℃室温下培养5 d后，得到与接种一致的菌落，确认该菌对离体叶片有致病力，进行幼苗根部接种试验。

2.2.2 幼苗根部接种

XJ160830菌株盆栽接种：树苗接种第8天开始出现叶片萎蔫，第15天植株出现与田间完全一致的症状（图2c）。接种30 d，处理植株全部死亡；對照生长正常。将接种感病的植株进行病原分离，得到与接种一致的菌落，确认为橡胶树速衰病的病原菌。

XJ160901菌株盆栽接种：树苗接种第10天出现叶片萎蔫，第15天植株出现与田间完全一致的症状（图2d）。接种30 d，处理植株全部死亡；对照生长正常。将接种感病的植株进行病原分离，得到与接种一致的菌落，确认为橡胶树速衰病的病原菌。

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 形态鉴定

XJ160830：在室温25～28℃下，菌丝在PDA培养基上生长速度较快，菌落直径平均日增长可达2.0 cm以上。菌落初期为白色（图3a），以后逐渐加深而成为黑褐色（图3b）。气生菌丝发达，绒毛状。新生菌丝无隔，无色透明。老化菌丝有隔，多细胞，不规则分支。在25～30℃室温，pH 3.5的PDA培养基上培养45 d后可形成子座，子座明显，近球形，表面密生绒状菌丝丛，大小为（2～3）mm×（2～3）mm。分生孢子初无色，单胞，卵圆形，基部平截，端部钝圆，壁厚，表面光滑，成熟后变成茶褐色，中央有一隔膜，椭圆形，表面光滑，大小（9.6～14.2）μm×（20.1～23.8）μm（图3c）。根据依据《真菌鉴定手册》[4]和文献[5]鉴定为可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae。

XJ160901：在25℃室温下培养5 d长成的菌落呈毛毡状，浅香槟色，菌丝紧贴培养基表面（图3 d），后逐渐转为香槟色，间有蓝色或绿色。在室温25℃下培养2～3 d，长出大量小型分生孢子，5～7 d后产生大型孢子。小型分生孢子多散生于菌丝间，干燥时呈粉末状。小型分生孢子长椭圆形、卵圆形、肾形，大小为（5.8～10.3）μm×（3.0～3.4）μm；大型分生孢子一般为3～5个隔，细长，微弯，顶端弯曲较明显，基部有足细胞，3个隔的（26.0～53.7）μm×（3.5～4.0）μm，5个隔的（35.0～58.0）μm×（4.0～5.2）μm（图3e）；培养30 d，未观察见厚垣孢子产生。分生孢子从表面的分生孢子梗上生出，分生孢子梗瓶状，少有分枝，每个分枝的顶端是一裸露的瓶状小梗（图3f）。依据《真菌鉴定手册》[4]和《The Fusarium Laboratory Manual》[6]對茄镰孢的形态特征的描述，鉴定该病原菌为Fusarium solani。

2.3.2 分子鉴定

XJ160830：利用ITS1/ITS4引物扩增获得527 bp ITS序列，将该ITS序列上传至NCBI，获得登录号KX932435.1，在NCBI网站上进行同源性比较，通过BLAST搜索核酸数据库显示，该序列与L. theobromae L15 （登录号KR260802.1）的ITS1，ITS2和5.8S rDNA序列相似性为99%。结合形态学鉴定结果，确认该病原菌为L. theobromae。

XJ160901：利用ITS1/ITS4引物扩增获得548 bp ITS序列，将该ITS序列上传至NCBI，获得登录号MF443133，在NCBI网站上进行同源性比较，通过BLAST搜索核酸数据库显示，该序列与F.solani DET33（登录号KX385049.1）的ITS1，ITS2和5.8S rDNA序列相似性为99%。结合形态学鉴定结果，确认该病原菌为F. solani。

2.4 病根镜检

两种症状的病根分别放在RH 60%～70%的室内10 d后，第一种症状树根表层长出许多黑色粉状物质，经镜检黑色粉状物质为分生孢子，与XJ160830菌落培养产生的分生孢子的形态、大小一致，确认为可可毛色二孢；第二种症状树根表层长出奶油白色霉层，经镜检白色霉层产生的分生孢子与XJ160901菌落培养产生的分生孢子的形态、大小一致，确认为茄镰孢。

3 讨论

本次调查云南主要植胶区的8个胶园，共采到37个标本，根据病原菌分离情况，L.theobromae为主要病原菌，分布广泛；F.solani为次要病原，零星发生。L.theobromae是一个宿主范围非常广泛的植物病原菌，可使各种热带和亚热带地区不同寄主的树干、根等发生病害。据国内外资料报道，L.theobromae可引起白木香枝枯[7]、肉桂枝枯[8]、高良姜叶枯[9]、葡萄藤溃疡[1012]、桑树根腐病[13]和橡胶树茎干流胶病[14]等病害的发生，F.solani引起橡胶树割面溃疡[15]，这两种病原菌引起橡胶树的根、树头感病死亡在国内橡胶种植上是首次报道。根病是橡胶树重要病害之一，在我国植胶区都有发生，是影响橡胶树平均产量提高的因素之一。据资料记载，我国已知的橡胶树根病有7种，病原菌分别为：红根病橡胶灵芝Ganoderma pseudoferreum、褐根病有害木层孔菌Phellinus noxius、紫根病紧密卷担菌Helicobasidium compactum、黑根病褐卧孔菌Poria hypobrunnea、白根病木质硬孔菌Rigidoporus lignosus、黑纹根病炭色克里兹氏菌Kretzschmaria deusta、臭根病蔓球束菌Sphaerostilbe repens，其中危害较重的是红根病、褐根病和紫根病[1]。橡胶树感染根病地上部分症状总体表现为：树冠稀疏，枯枝多，不抽顶芽或抽芽不均匀，叶片变小、变黄和无光泽，有的叶片还皱缩，至橡胶树发生死亡有一个较长时间的过程。各种根病诊断的主要依据是：在病根上生长的菌丝体合并形成根状菌索或菌膜的形态和色泽、病根的外观、质地及气味，生长在腐木地上部分子实体形状及颜色。L.theobromae和F.solani引起橡胶树根部、树头感病症状与已知橡胶树根病症状有明显区别：首先，感病植株地上部分死亡前正常，未出现枝枯、叶片变小、皱缩等症状；其次，在感病根上和树头未见明显的根状菌索或菌膜；第三，发病特点表现为发病急，死亡快，病害症状出现后无法挽救，即叶片突然失水萎蔫、不落叶，一周后干枯的叶片才逐渐脱落，树干也逐渐干枯。L.theobromae和F.solani引起橡胶树的速衰症状在地上部无明显差异，主要区别在于根部和树头感病症状：L.theobromae感染在感病根上和树头表面可以见到煤灰样黑色物质、凝胶等，而F.solani感染却没有这个特征。橡胶树速衰病有的是发生在原来红根病、褐根病等老根病区周围，与红根病、褐根病等形成混合型病区；有的是独立发生形成病区，此类病区死亡橡胶树残桩上没有子实体生长。红根病和褐根病等已知根病死亡的树头残桩上一般有子实体生长，病根有蘑菇味，而L.theobromae和F.solani引起死亡树头残桩上没有子实体，病根也无蘑菇味，这些是红根病、褐根病等已知根病与L.theobromae和F.solani最简单、方便的识别方法。

橡胶树速衰病在山地一般4-11月发生，8-10月为高峰期；在冬春季有一定量的降水时，春季2-3月份也会有发生；在水分保持较好的缓坡地周年均可发生。调查橡胶树速衰病的传播方式时发现，其传播方式与其他根病的相似：挖开感病死亡树可以见到已经枯腐或感病严重的病根与树头相连，这是最早感病的根，同时挖开与感病死亡树相邻的健康树中间根交错的地方，多数可以发现有健康树的根与病根交错在一起，有的根已感病；将感病的根带回实验室进行保湿观察，一般都能观察到在病根表面出现黑色点状物质或白色菌丝，镜检可分别看到可可色二孢和茄镰孢的分生孢子；但橡胶树速衰病较其他已知根病传播速度快、死亡率高，对橡胶生产是极其危险的病害。调查根病区的形成過程发现：平地、缓坡地的发病率、传播速度较坡地高、快，在平地，常以最早感病死亡的树为中心向周围辐射扩散，形成病区；在坡地，一般向左右和向下扩散形成病区，向上扩散的概率较低。根据以上调查，笔者认为橡胶树速衰病的传播方式主要有两种：一是根与根接触传播，二是病残体上形成的分生孢子随雨水流动传播。

在根病防治试验过程中发生施药处理后有的参试橡胶树发生突然死亡的现象，在对死亡原因调查过程中发现了致病菌可可毛色二孢和茄镰孢，这或许就是导致试验结果发生异常的主要原因，同时也是云南橡胶树根病没有得到有效控制的原因之一。在同一根病区中既有红根病，又有褐根病，同时还存在速衰病等不同种类根病混合发生的现象，因而，橡胶树根病控制技术还需要进一步深入研究和完善。

参考文献

[1] 中国农业科学院植物保护研究所，中国植物保护学会.中国农作物病虫害（第3卷）[M].北京：中国农业出版社，2015：212213.

[2] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998：123126.

[3] WHITE T J， BRUNS T， LEES S， et al. Amplification and direct sequencing on fungal ribosomal genes for phylogenetics[M]∥INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR protocols： a guide to methods and applications. San Diego： Academic Press， 1990： 315.

[4] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979：162164.

[5] LATHA P， PRAKASAM V， KAMALAKANNAN A， et al. First report of Lasiodiplodia theobromae （Pat.） Griffon & Maubl causing root rot and collar rot disease of physic nut（Jatropha curcas L.） in India[J]. Australasian Plant Disease Notes， 2009， 4（1）：1920.

[6] LESLIE J F， SUMMERELL B A， BULLOCK S. The fusarium laboratory manual [M]. Blackwell Publishing， 2006： 250251.

[7] 张争，杨云，魏建和，等.白木香枝枯病病原菌的鉴定[J].中国中药杂志，2013，38（11）：17071711.

[8] 薛振南，黄式玲，李孝忠.肉桂枝枯病菌及其生物学特性研究[J].广西农业生物科学，2003，22（4）：275279.

[9] 陈旭玉，甘炳春，冯锦东.高良姜叶枯病病原菌的分离和鉴定[J].安徽农业科学，2014，42（16）：50315032.

[10]史国英，胡春锦，罗掉爱，等.毛葡萄穗轴褐腐病病原菌鉴定及其生物学特性[J].植物病理学报，2010，40（3）：242249.

[11]谢红辉，韦继光，黄穗萍，等.一种真菌类病原菌引发桑树根腐病的发生规律及光照对病原菌生长的影响[J].蚕业科学，2016，42（1）：4552.

[12]URBEZTORRES J R， LEAVITT G M， GUERRERO J C， et al. Identification and pathogenicity of Lasiodiplodia theobromae and Diplodia seriata， the causal agents of bot canker disease of grapevines in Mexico [J]. Plant Disease， 2008， 92（4）： 519529.

[13]RODRGUEZGLVEZ E， MALDONADO E， ALVES A.Identification and pathogenicity of Lasiodiplodia theobromae causing dieback of table grapes in Peru[J]. European Journal of Plant Pathology， 2014， 141（3）： 477489.

[14]黄贵修，许光灿.中国天然橡胶病虫草害识别与防治[M].北京：中国农业出版社，2012：47.

[15]蒋桂芝，刘一贤，王勇方，等.爪哇镰刀菌引起的橡胶树割面溃疡病的初步研究[J].热带农业科技，2016，39（2）：46.

（责任编辑：田 喆）