两性霉素B发酵染菌的原因分析及降低染菌率的措施

马亦蓉

（上海上药新亚药业有限公司，上海201203）

0 引言

虽然两性霉素B是由含37个碳原子组成的大环内酯乳糖七烯类的抗生素，是治疗全身性深度真菌感染的唯一有效药物，但其副作用大、毒性大，而两性霉素B脂质体能有效弥补这一缺陷。

作为两性霉素B脂质体的原料来源——两性霉素B，采用生物合成法（微生物发酵法）生产，利用两性霉素B的产生菌，在一定的条件（包括培养基、温度、pH、通气、搅拌等）下使其生长繁殖，并在代谢过程中产生两性霉素B，再用溶媒结晶法将两性霉素B从发酵液中提取出来，加以精制，最后获得两性霉素B成品。

两性霉素B的生产工艺（菌种→孢子制备→种子制备→发酵）属于发酵生产工艺。然而，发酵生产工艺要求，除大量繁殖两性霉素B的产生菌外，不允许其他杂菌（即染菌）的生长。染菌不仅消耗培养基中的营养成分，还会分泌某些对产生菌有毒性或者能使两性霉素B失去活性的物质。同时，降低两性霉素B的发酵单位，严重时会导致“倒罐”，即发酵过程中出现了较为严重的染菌现象，意味着发酵失败。因此，防止染菌，降低染菌率是发酵生产中一项长期、重要的工作。

本文从多方面入手，分析可能造成两性霉素B发酵染菌的原因，并通过制定相应的措施，降低染菌率。

1 发酵生产简介

1.1 工艺流程

两性霉素B的发酵工艺流程如图1所示。

1.2 设备流程

两性霉素B的发酵设备流程如图2所示。

1.3 关键工艺简述

将节状链霉菌（Str.nodosus）培育至生产菌株，需经种子阶段、发酵阶段的通气培养，培养基由葡萄糖等原料作为碳源、酵母粉等原料作为氮源，并添加微量元素，整个培养繁殖过程应保持严格的纯种状态。

在整个发酵过程中，需全程进行杂菌试验，以此来判断发酵过程是否染菌。通过观察菌种外观、镜检等手段来判断从一级发酵进入二级发酵（移种）的时机。两性霉素B经过发酵周期后，发酵液经酸化过滤，收集滤饼（两性霉素B菌丝体）。

图1 两性霉素B的发酵工艺流程

图2 两性霉素B的发酵设备流程

2 染菌事件的调查

在两性霉素B发酵生产中发生了染菌事件，通过调查发现，其均为二级发酵间歇染菌，调查结果如表1所示，染菌情况严重，造成发酵效价低，过滤困难，只能作“倒罐”处理。

从表1可以看出：12批两性霉素B发酵的染菌率为50%，染菌情况严峻。

3 染菌原因分析及要因确认

两性霉素B发酵生产中的染菌原因分析及要因确认如表2所示。

在两性霉素B发酵生产的染菌事故调查中，经过染菌原因分析及要因确认后，汇总并制成染菌原因鱼刺分析图，如图3所示。

4 采取的控制措施

根据两性霉素B的染菌原因鱼刺分析图，针对引发染菌的主要原因，制定相应的控制措施，如表3所示。

4.1 空气系统中水分过多

总空气过滤器的失效多数是由空气系统中水分过多造成，若不能有效除湿，过滤介质极易失效，引起污染。针对这一情况，应落实专人负责空气系统的管理，定期检查，定时消毒，及时放出冷凝水，并对空气在进入总过滤器之前加热升温，使得相对

表1 两性霉素B发酵生产中染菌情况的调查

表2 两性霉素B发酵生产中的染菌原因分析及要因确认

4.2 罐体渗漏

图3 两性霉素B的染菌原因鱼刺分析图

表3 控制措施

对发酵罐进行大范围检修，在罐体内电焊捉漏，检查夹套是否腐蚀穿孔，检查管道和连接部件安装是否合理；对罐壁、电焊缝渗漏处作相应处理，严密堵漏。

4.3 罐内设计不合理

（1）针对空气分布口偏高，影响发酵液吸收溶氧的情况，应降低空气分布板位置，使分布口高度适宜，使发酵液有效吸收溶氧。

（2）针对罐内出料管道口距罐底距离过大，影响发酵罐清洗，从而造成发酵罐染菌的情况，应把原来高度在100mm左右出料的管道口改为基本接近罐底。

（3）针对排汽管道细，排汽不流畅，出现死角的情况，应清理旋风器，增加排汽出口，减少排汽死角。

4.4 蒸汽供应压力低或不稳定

蒸汽供应的压力稳定是保证发酵系统有效灭菌的基础。若蒸汽压力不稳定，就会因为灭菌不彻底造成污染；若蒸汽压力低，就会造成灭菌时间长，进而破坏培养基。

一般蒸汽由动力车间供应，因此，应保证足够压力的饱和蒸汽及其稳定性。

4.5 灭菌操作不到位

（1）为了提高相关操作人员的素质，应对操作人员进行SOP教育培训，并进行考核；

（2）强化管理，严格要求员工按照岗位SOP操作，认真控制预热温度、罐温及维持罐内培养基温度，严格控制进料流量，保证灭菌质量；

（3）抽查操作人员的工作情况，并与工资、奖金挂钩。

4.6 工艺弱点

针对消毒时液面高的现象，可提高某培养基使用比例，降低另一培养基使用比例，使消毒液面得以有效控制。

5 效果检查与对比

在针对两性霉素B的染菌主因，制定并落实了相应的控制措施后，染菌情况大为改观，染菌率直线下降，具体效果如表4所示。图4为改进前后两性霉素B的平均效价对比，图5为改进前后两性霉素B的染菌率对比。

图5 改进前后两性霉素B的染菌率对比

从表4可以看出：12批两性霉素B发酵的染菌率为8.33%，染菌问题大有改观。

6 结语

本文从两性霉素B的发酵工艺入手，介绍了两性霉素B的发酵工艺流程和设备流程，通过分析可能造成发酵染菌的原因，结合实际情况，确定了发酵染菌的主要原因，并制定了相应的控制措施，改进后的染菌情况大为改观。

表4 改进后的染菌效果数据

图4 改进前后两性霉素B的平均效价对比

同时，建议采取以下巩固措施：

（1）制定管理标准，加强对设备等的定期检查力度，每月进行检查、维修，发现问题及时解决；

（2）修正工艺规程，并写入标准操作规程；

（3）制定岗位培训计划，对员工定期进行各项规章制度、岗位操作规程及相关文件的培训，并严格遵照执行。

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