生物膜形成对植物乳杆菌PG3-1耐受性及功能基因表达的影响

张国丽，杨陈文，余茜，陈安均，刘书亮,2，敖晓琳,2*

1(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625000)2(四川农业大学 食品加工与安全研究所，四川 雅安，625000)

植物乳杆菌在发酵食品中应用十分广泛，其生理活性以及稳定性对食品加工有着重要影响。高温会导致蛋白质变性，膜结构破坏以及核酸分子受损等。在植物乳杆菌的工业应用过程中常常会伴随一些高温的过程，如喷雾干燥、巴氏灭菌等，此外热耐受还与植物乳杆菌的长期保藏成正相关。因此提高乳杆菌的耐受能力对于提高植物乳杆菌的商业价值有重要意义。

1978年美国学者COSTERTON提出了生物膜(Biofilm)这一专有名词[1-2]，它主要是由附着于生物或者非生物实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的基质所组成。当细菌受到各种胁迫，如营养缺乏或营养过剩，低pH值，高渗透压，抗菌剂和抗生素等，在这些不利的环境下，大量的细菌通过自身合成的水合多聚物粘附在固体表面，以固着的方式生长从而形成生物膜。这是细菌所具有的一种非常重要的环境适应机制[3]。

生物膜在食品加工与安全领域具有重要的研究价值，生物膜的形成能促进有益微生物对不利环境的适应能力，使其具有良好的稳定性，可解决发酵剂不稳定等食品工业中的实际问题。但食品工业的原辅料、食品加工机械表面和管道内以及生产环境中很容易出现生物膜，生物膜的特殊结构可以使其耐受消毒剂的作用而得以残存，进而可以再次污染食品，如果是病原菌，则可能造成极大的食品安全隐患[4-5]。

细菌在受到不同程度的环境因子刺激，如热、酸、盐等刺激，应激蛋白在细胞生长、发育、分化过程中的基因转录、蛋白质合成、折叠、跨膜运输、分解和立体构象的维持等方面发挥重要作用，可抵御不良环境，典型代表为热休克蛋白(heat shock protein，HSP)，该蛋白广泛分布于微生物、动物、植物等各种生物体内，其中DnaK、GroEL热激蛋白，可通过调节蛋白质修复和折叠作用，从而保护蛋白质形态、功能特性[6]，与生物膜的形成息息相关。

本试验研究了植物乳杆菌PG3-1生物膜形成后对其耐受性的影响，并从基因表达水平分析解释该类现象，为更好的发挥植物乳杆菌的益生功能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

植物乳杆菌(LactobacillusplantarumPG3-1，NCBI登录号：AB617650)，分离自传统制作的泡菜老盐水中，具有优良的发酵性能。

MRS肉汤、试验培养基(牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，葡萄糖20 g，柠檬酸5 g，胰蛋白胨25 g，果胶0.5 g，氯化钠40 g，乳粉15 g，蒸馏水1 000 mL)，琼脂糖等，以上生化试剂均为国产分析纯或市售。

试剂盒：Biozol RNA Mini Kit，Biomiga公司；HisScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，Vazyme 公司；2×SYBR Mixture，荧光定量PCR板膜，Biomiga公司；96孔细胞培养板，Haimen Boyang仪器设备公司。

1.2 仪器与设备

3001型酶标仪，Thermo Scientific 公司；BPC-250F生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；DHG-9245A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1F超净操作台，苏州净化；SYQ-DSX-280B压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；PHS-4C+酸度计，成都世纪方舟科技有限公司；D2KW-5-4电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；CFX Connect Real-time PCR仪，BIO-RAD公司；Gel Doc XR凝胶成像仪，BIO-RAD公司；SORVALL高速离心机，美国科骏仪器有限公司；DY-A电泳仪，上海康达仪器厂。EVO18扫描电镜，Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳杆菌生物膜形成菌株和浮游菌株的制备

生物膜菌株(实验组)：将过夜活化培养后的植物乳杆菌按5×107CFU/mL接入试验培养基，振荡摇匀后按照每孔200 μL的添加量添加到96孔板中42 ℃培养36 h。该接种和培养条件参照实验室前期试验结果。以相应等体积空白培养基作为阴性对照。

浮游菌株(对照组)：将活化后的植物乳杆菌按1×105CFU/mL接入MRS肉汤培养基，振荡摇匀后按照每孔200 μL的添加量添加到96孔板中37 ℃下培养36 h。以相应等体积空白培养基作为阴性对照。

1.3.2 植物乳杆菌生物膜的定量测定

培养完成之后的培养液倒出，每孔加入200～300 μL无菌水清洗，将结合不紧密及游离菌体清除。风干后加入0.5%结晶紫染液50 μL染30 min。倒掉染液，每孔加入250 μL无菌水洗3次。风干后采用酶标仪检测490 nm处OD值。以A490值定量生物膜形成量，A490小于等于0.17时表明无生物膜形成，A490大于0.34时表明生物膜大量形成[7]。

1.3.3 植物乳杆菌生物膜的形态观察

将约1 cm×1 cm经过70%酒精浸泡、清洁的盖玻片置于培养基中，让植物乳杆菌在培养过程中自然黏附聚集在玻片上，培养完成之后取出玻片，置于2%戊二醛磷酸缓冲液中，于4 ℃冰箱中固定过夜，次日以磷酸缓冲液冲洗，分别用40%、70%、90%、100%的乙醇依次脱水，每次15 min。脱水后，用醋酸戊酯置换乙醇，再进行干燥、镀金及扫描电镜观察[8]，观察生物膜形成情况，以浮游菌株作为对照。

1.3.4 植物乳杆菌生物膜耐受性的测定

同一批次培养多管实验组和对照组菌株，实验组单独通过离心、冲洗、浓缩、打散、重悬等一系列过程，测定对照组及实验组初始活菌数。

(1)对温度的耐受性：参照司淼菲[9]的方法，参考初始活菌数将实验组与对照组分别按106CFU/mL接种量接种到5 mL的MRS液体培养基中，然后分别在50 、55 、60 、65 、70 ℃水浴条件下静置1 h，进行平板活菌计数，比较生物膜菌株和浮游菌株对温度耐受性的差异，每组3个平行。

(2)对酸碱度的耐受性：参照KUBOTA[10]的方法，将实验组和对照组分别按106CFU/mL的接种量分别接种到pH值2、3、4、8、9、10的MRS液体培养基中，37 ℃静置处理2 h，进行平板活菌计数，比较生物膜菌株和浮游菌株对酸碱度耐受能力的差异，每组3个平行。

(3)对盐度的耐受性：将实验组与对照组分别按106CFU/mL接种量分别接种到添加有6%、8%、10%、12%、14% NaCl的MRS液体培养基中，37 ℃静置处理2 h，进行活菌计数，比较生物膜菌株和浮游菌株对不同盐度耐受能力的差异，每组3个平行。

1.3.5 生物膜菌株和浮游菌株功能基因相对表达量的测定

分别提取植物乳杆菌生物膜菌株和浮游菌株总RNA。提取的样品经紫外分光光度计检测达到OD260/OD280为1.8～2.0，保存于-20 ℃冰箱中备用。

逆转录：将所得RNA采用试剂盒转录成cDNA，保存于-20 ℃冰箱中备用。体系(20 μL)：2×RTmix 10 μL，酶2 μL，寡核苷酸1 μL，随机六聚体1 μL，RNA模板6 μL。

逆转录反应程序：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min。

引物设计：根据根据Gene Bank提供的GroEL、Dank基因序列，应用Oligo软件，设计了针对特异性定量引物用于实时荧光定量PCR反应，以16S rRNA作为内参基因[11]，引物信息如表1。以上引物均由上海生工生物工程公司合成。

表1 引物信息表Table 1 Primer information table

实时荧光定量PCR扩增体系：SYBR 2×5μL ，上游引物0.2 μL(10 μmol/L)，下游引物0.2 μL(10 μmol/L) ，梯度稀释cDNA模板0.4 μL，ddH2O补足至10 μL。

反应程序：95 ℃预变性10 min ，95 ℃变性15 s，退火1 min，40个循环。反应结束后记录CT值，每个处理3次重复。溶解曲线：95 ℃，10 s；65 ℃，5 s；95 ℃，50 s。

相对表达量计算：采用EXCEL以及SPSS 17. 0统计软件进行数据分析。基因相对表达量的计算采用2-ΔΔCt方法进行分析[12]。其中：

相对表达量 = 2-ΔΔCt

(1)

ΔΔCt =(Ct实验组-Ct实验组内参)-(Ct对照组-Ct对照组内参)

(2)

2 结果与分析

2.1 生物膜菌株的测定结果

经测定，实验组A490值为4.492 3，对照组A490值为0.136 5。对具有成熟生物膜的植物乳杆菌和浮游菌株进行扫描电镜观察，所形成的生物膜较游离菌体具有大量的胞外聚合物包被，整个膜有孔洞，具有典型的生物膜结构(图1-b)，对照组中植物乳杆菌菌体形态清晰可见，没有包被物，菌体呈游离状态(图1-a)。

图1 植物乳杆菌生物膜以及游离菌体扫描电镜图
Fig.1 SEM of biofilm and planktonic L. plantarum

2.2 生物膜形成对植物乳杆菌耐受性的影响

2.2.1 生物膜形成对植物乳杆菌酸碱耐受性的影响

环境pH值对微生物的生长至关重要，可以通过影响细胞膜表面电荷的性质及通透性从而影响对物质的吸收能力，或者通过改变酶活、酶促反应等影响新陈代谢。酸性条件是乳酸菌自然发酵过程中的重要环境特征。乳杆菌发酵的主要产物乳酸的pKa=3.86，细胞内的乳酸分子通过去游离化和游离化作用来调控细胞从对数生长期进入稳定生长期，但是作为益生菌的乳杆菌服用后经过胃部到达肠前时将会经受极端的酸性条件。碱性条件下则不利于乳酸菌的生长繁殖，本试验对植物乳杆菌生物膜形成后对偏酸和偏碱环境的耐受能力均进行了测定，结果如图2所示，随着酸度或碱度的增大，实验组和对照组的耐受能力均下降，在不利的环境因素下，微生物的存活受到威胁，但实验组总体上较对照组表现出更佳的耐受能力，表明生物膜形成之后，植物乳杆菌对酸碱的耐受能力有所提高，可有利于使用植物乳杆菌发酵生产一些酸度较高的食品，该试验结果与HIROMI[10]等的试验结果类似。在pH值小于3的范围内，实验组与对照组的存活率都很低，实验组没有明显的优势，表明生物膜结构在极端环境中也会被破坏，失去对菌体的保护作用。

图2 生物膜形成菌株与浮游菌株的酸碱耐受性
Fig.2 the tolerance to pH of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小写字母代表差异显著，p<0.05)

2.2.2 生物膜形成对植物乳杆菌温度耐受性的影响

高温会影响菌株的生长和代谢，对于大多数乳酸菌在60 ℃左右就会死亡。生物膜形成对植物乳杆菌温度耐受性的影响结果如图3所示。

图3 生物膜形成菌株与浮游菌株对温度的耐受性
Fig.3 the tolerance to temperature of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小写字母代表差异显著，p<0.05)

随着温度的升高，对照组和实验组的存活率均下降，但是生物膜形成菌株在同样温度下较之于浮游菌株具有更好的耐受性，最高耐受温度提高至70 ℃，可能原因是在生物膜培养过程中受到较高温度的刺激与诱导，提高了植物乳杆菌的热应激能力，在经过热适应之后具有更好的温度耐受性。当温度达到65 ℃及以上时，实验组与对照组存活率都很低，表明生物膜的保护作用具有一定限度。在益生菌发酵食品中，某些产品需要经过简单的巴氏灭菌处理来杀灭导致腐败的杂菌，但是在杀灭杂菌的同时也会导致益生菌的死亡，若能利用植物乳杆菌生物膜形成的保护作用提高其对温度的耐受性，就可以通过低温杀菌方式杀灭腐败微生物，有益微生物可以存在于食品之中。

2.2.3 生物膜形成对植物乳杆菌盐度耐受性的影响

植物乳杆菌生物膜形成对盐度耐受性的影响如图4所示，随着盐浓度的增加，对照组与实验组的存活率均下降，但实验组总体的耐受性高于对照组，表明植物乳杆菌生物膜形成之后对盐度的耐受性有所提高。在发酵高盐度食品时，利用植物乳杆菌生物膜形成的保护作用能够很好的耐受高盐度，有利于发酵的顺利进行。

图4 生物膜形成菌株与浮游菌株对盐度的耐受性
Fig.4 The tolerance to NaCl of biofilm and planktonic L. plantarum
(不同大小写字母代表差异显著，p<0.05)

植物乳杆菌在自然生长过程中通常会暴露在一定浓度的盐溶液中，而细胞质的浓度须与外界保持一致。当菌体突然暴露在高渗环境(如高浓度的盐溶液)中时，环境渗透压的改变会影响细胞的重要生理功能，细菌为了存活则需要适应这种环境变化，细胞会通过向胞外运输水分，从而改变胞内渗透压和细胞体积来适应高渗环境。而生物膜形成的保护结构可能在一定程度上减少了高盐浓度的进入来应对这种环境胁迫。

2.3 功能基因相对表达量的确定

2.3.1 内参基因的扩增

将cDNA模板分别稀释0，10，102，103，104，105，106，107倍，按照体系进行荧光定量PCR，确定最佳稀释倍数为100倍。通过内参基因的溶解曲线(图5)可以观察到在80～85 ℃之间出现单一的峰，没有杂峰出现，溶解峰对应的值与扩增产物的理论非常接近，证明内参基因扩增产物为单一特异性产物。实时反转PCR受到RNA的不稳定性，RNA提取方法的不稳定性，逆转效率和PCR效率等因素的影响。本实验采用保守的基因作为内参(16S rRNA)对定量方法进行标准化来消除上述因素对结果的影响。

图5 内参基因溶解曲线
Fig.5 Melt curve of reference gene

2.3.2 目的基因扩增结果

通过图6和图7可以观察到目的基因在75～80 ℃出现单一的峰，目的基因的引物特异性较好，没有杂峰和引物二聚体的岀现，溶解峰对应的值与扩增产物的理论值非常接近，表明目的基因扩增产物为单一特异性产物。

图6 GroEL基因溶解曲线
Fig.6 Melt curve of GroEL gene

图7 DanK基因溶解曲线
Fig.7 Melt curve of DanK gene

M-2 000 bp的DNA标记； 1-2-16S rRNA内参基因；3-DanK基因
图8 内参基因及DanK基因扩增结果
Fig.8 Electrophoresis results of reference gene and DanK gene

M-2 000 bp的DNA标记； 3-4-GroEL 基因
图9 GroEL基因扩增结果
Fig.9 Electrophoresis result of GroEL gene

2.3.3 基因相对表达量的确定

实时荧光定量技术是通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量，进而据此推断目的基因的初始含量。利用该方法对植物乳杆菌生物膜菌株和浮游菌株各功能基因进行相对定量分析，结果如图10所示。DnaK，GroEL 基因的相对表达量分别达到1.53，3.22。结果表明，生物膜成熟过程中受到热胁迫等环境影响，DnaK、GroEL基因表达量增高，与焦凌霞[13]的实验结果类似，学者对酸土脂环酸芽孢杆菌进行70～90 ℃热胁迫，DnaK基因的表达量也提高至1～2.5倍不等。2种热应激基因对植物乳杆菌在高温逆境下的生存于生物膜的形成起着重要作用。

图10 基因相对表达量
Fig.10 The relative expression of genes

3 讨论

细菌生物膜的形成过程牵涉到多种基因的表达以及复杂的蛋白调控机制[14]。本试验表明，植物乳杆菌生物膜形成之后相关应激基因的表达量提高，且对环境的适应能力和耐受性也相应提高，表明其生物膜的形成与各种应激行为密不可分，在成膜过程中受到各种环境胁迫，产生相应的应激行为，调控了菌体对不良环境的耐受力。乳酸菌的应激研究目前已较为全面，但是将生物膜的形成与应激行为和环境耐受力相结合的研究较为少见。

DnaK、GroEL生物学功能广泛，而且在生物体内广泛地参与了多种复杂的功能，与生物在高温、酸、碱、氧化应激等逆境下的生存关系密切。热激蛋白在受到各种环境胁迫时都会受到诱导表达上调。环境渗透压升高，会对蛋白质二级结构有破坏作用，GroEL基因面对渗透胁迫则会受到诱导表达上调，起到保护蛋白质的目的。在此环境胁迫下与调控下也促进了生物膜的形成。

刘倩颖[15]的试验研究表明，在盐胁迫下，GroEL基因的表达量会增加至4倍左右，在本实验植物乳杆菌生物膜的成熟过程也受到盐胁迫，说明该基因在盐胁迫下其相对表达量也会受到影响，可能一个基因同时调控着细菌的多种环境应激行为。

应激基因的相对表达量变化在表型试验中也得以验证。酸、高温胁迫下会导致一些相关的酸敏感酶的活性丧失，细胞膜、大分子物质的结构损坏等，菌体与菌体之间也会有协同或拮抗行为的产生。植物乳杆菌会通过自身适应性调节来消除部分不利影响，涉及的可能机制包括细胞膜组成的改变、应激蛋白和分子伴侣的诱导产生、转录调控的表达等。适应性调节可能是上述一种机制的作用，也可能是多种机制的综合结果，仍需进一步研究确定。

高渗条件通常由盐类或糖类溶质引起，植物乳杆菌通常情况下能自我平衡胞内胞外的一定盐或糖浓度。在高渗透压条件下，可在细胞内积累相容性溶质；在低渗透压条件下，可以通过向细胞外部释放相容性溶质。通过调节相容性溶质在细胞内含量这样的方式，达到保护菌体的目的。

植物乳杆菌生物膜形成之后，其对环境的耐受性相应提高，可利用生物膜的形成有利于抵抗环境胁迫压力，通过调控生物膜的形成促进有益微生物聚集，提高发酵菌种稳定性与活力，从而提高发酵食品品质。

4 结论

研究了植物乳杆菌PG3-1生物膜形成之后环境耐受力的变化以及相关功能基因表达量的变化，结果表明，生物膜形成后菌株对温度、酸碱度、盐度耐受性均有不同程度的提高，且与其功能基因的表达存在一定关联，植物乳杆菌生物膜形成过程中发生热应激、酸应激、盐应激等应激行为，GroEL、DanK热应激基因的相对表达量达到3.22、1.53，更为深入的相互关系还需要进一步探索。