丙烯酰胺母源性暴露对仔鼠海马齿状回DCX和GAP⁃43表达的影响

杨德慧 赖胜敏 古梓婷 刘鸿庆 马宇昕 罗利 李国营 刘靖

广东药科大学基础学院人体解剖学教研室（广州 510006）

丙烯酰胺（acrylamide，ACR）是一种可溶于水的乙烯基单体，其复合体聚丙烯酰胺广泛应用于化工行业［1］。业已证实ACR对人和动物具有神经毒性，能够选择性地损害中枢神经和周围神经的神经元终末，出现共济失调、肢体乏力、四肢麻木、感觉障碍等一系列临床症状［2］。然而关于ACR神经发育毒性报道较少，胎儿和婴儿正处于神经系统发育重要阶段，特别是血脑屏障尚未发育成熟，可能更容易受到各种有害因素的损伤，特别是神经毒物。在中枢神经系统发育过程中，双皮质素（doublecortin，DCX）和生长相关蛋白⁃43（growth associated protein⁃34，GAP⁃43）共同参与了神经元生成和发育的全过程。其中，DCX是一种微管相关蛋白，在神经元分化和迁移过程中阶段性地表达于神经元的突起和胞体上，其阳性细胞的数量可以反映海马齿状回新生神经元的增殖情况［3］。另外，GAP⁃43是一种促进神经元修复与合成的胞膜上的特异性磷酸蛋白，能够促进神经元轴突的延伸［4］。

因此，本实验通过建立ACR母源性暴露，检测仔鼠海马齿状回DCX和GAP⁃43的表达情况进行探讨ACR对神经元的生长发育的影响，为研究ACR的神经发育毒性提供理论和实验依据，有利于优生优育。

1 材料与方法

1.1 主要试剂ACR（美国Sigma公司，纯度99.9%）、Rabbit Anti⁃DCX（美国 Abcam 公司）、Rabbit Anti⁃GAP⁃34（武汉博士德生物公司）、HRP标记山羊抗兔（美国Ear thox公司）。

1.2 实验动物6周龄级SD大鼠由广东省医学实验动物中心提供，许可证号SCXK（粤）2013⁃0002。雌鼠32只，雄鼠16只，体质量140～160 g，所有实验动物在SPF级的条件下自由摄食和饮水，雌鼠怀孕后单笼饲养。

1.3 动物分组及染毒SD大鼠体成熟后，雌雄以1∶1进行交配，孕鼠随机分为4组，分别为对照组（0 mg/kg）、低（4.5 mg/kg）、中（9 mg/kg）和高（18 mg/kg）剂量组，每组8只。于母鼠妊娠第15天开始灌胃给药，连续给药至分娩后第13天，分娩后第14天，对仔鼠进行取材。

1.4 动物取材仔鼠出生后第14天，在4%水合氯醛腹腔注射麻醉下，以0.9%生理盐水冲洗和4%多聚甲醛溶液灌注，灌注固定后取脑置于4%多聚甲醛中固定48 h，组织常规脱水和石蜡包埋，用于免疫组织化学检测。

1.5 免疫组织化学检测切片常规脱蜡至水，在0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸缓冲液中微波修复20 min，3%H2O2⁃PBS室温处理30 min，5%BSA封闭液37℃封闭30 min，于4℃冰箱孵育一抗过夜。次日滴加HRP标记的二抗在37℃孵育40 min。DAB显色4.5 min，切片置于ddH2O终止显色。苏木素染色15 s，自来水返蓝2 min。切片继续脱水后用中性树脂封片。封片后选取每组每只大鼠2张切片，随机选取3个视野，用Image pro⁃plus 6.0图像分析软件计算免疫阳性表达物积分光密度值（IOD）。

1.6 统计学方法利用Image pro⁃plus 6.0图像分析软件进行光密度值分析，阳性表达物的平均光密度值，以表示，结果采用统计软件SPSS 17.0进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACR对P14仔鼠海马齿状回GAP⁃43表达的影响 见图1，GAP⁃43阳性表达物为黄棕色物质，环绕细胞核分布，呈中空状。GAP⁃43能够调节轴突的生长，是神经元发育过程中的标志位之一。与对照组和低剂量组相比较，中、高剂量组仔鼠海马齿状回GAP⁃43均明显有减少（P＜0.01）。见图2。

图1 各实验组仔鼠海马GAP⁃43的表达情况（IHC×400）Fig.1 Effect of ACR on expression of GFAP in the hippocampal mother rats

表1 ACR染毒对仔鼠海马齿状回GAP⁃43表达的影响Tab.1 Effect of ACR on expression of GAP⁃43 in the hippocampal dentate of offsprings（n=8） x± s

2.2 ACR对P14仔鼠海马齿状回DCX表达的影响本实验通过免疫组织化学方法检测P14仔鼠海马齿状回中DCX的阳性表达来检测神经元突起形成的情况。与对照组相比较，ACR中、高剂量组仔鼠海马齿状回DCX的阳性表达物均显著减少（P＜0.01）。

3 讨论

图2 各实验组仔鼠海马DCX的表达情况（IHC×400）Fig.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal mother rats

表2 ACR染毒对仔鼠海马齿状回DCX表达的影响Tab.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal dentate of offsprings（n=8）±s

表2 ACR染毒对仔鼠海马齿状回DCX表达的影响Tab.2 Effect of ACR on expression of DCX in the hippocampal dentate of offsprings（n=8）±s

注：与对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别对照组低剂量组中剂量组高剂量组IOD of DCX 9.37±0.70 7.75±0.39 6.21±0.33*4.43±0.56**

ACR是生产聚丙烯酰胺的原材料，广泛应用于各行业。动物实验业已证实ACR具有多种毒性，并在人体发现其神经毒性。ACR可以通过多种途径进行传播，胎盘和哺乳亦是ACR传播的方式［1］。ACR的神经毒性具有累积性，低剂量长期染毒和高剂量短期染毒均可导致明显的神经毒性［5］。ACR母源性暴露后，胎儿和婴儿的健康与安全受到威胁［6］。海马属于边缘系统的一部分，不但与学习、记忆、情绪等相关，其中齿状回颗粒下层（subgranular zone，SGZ）更是神经发生和神经再生的重要部位之一。神经干细胞位于海马门区与颗粒细胞层之间的颗粒下层，新生成的神经元从颗粒下层移入颗粒层，接受突触传入冲动，把轴突伸进苔状纤维通路，整合到海马功能的神经环路中，参与海马的学习记忆等功能活动［7］。有研究显示，母鼠通过饮水摄入ACR后，仔鼠海马齿状回Reelin免疫反应细胞和谷氨酸脱羧酶67免疫反应细胞呈剂量依赖性的增加，ACR干扰了海马齿状回神经元的迁移和定位［8］。而在中枢神经系统的发育过程中，神经元所分泌的蛋白GAP⁃43和DCX共同参与调节神经元的生长与发育。因此，我们通过检测仔鼠海马GAP⁃43和DCX表达情况，研究ACR对神经元发育的影响。

在本研究中，ACR暴露后，与对照组相比较，中、高剂量组仔鼠海马齿状回GAP⁃43的表达明显下降。GAP⁃43是一种磷酸蛋白，特异性地表达于神经元胞膜上，调节轴突的生长、突触的形成和神经递质的释放［9-10］。在神经元发育过程中，GAP⁃43引导轴突生长和调节突触联系中发挥着重要作用［9］。GAP⁃43表达的含量与轴突的生长、突触的塑造状态相一致［11］。在神经系统发育过程中，GAP⁃43有较高的表达，被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子，能够促进神经元轴突的生长［12］。GAP⁃43的减少将降低轴突结构的可塑性，包括轴突与树突的发芽，其表达与神经元轴突和树突的功能呈正相关［13⁃14］。由此笔者推测，GAP⁃43表达减少后，神经元轴突和树突的发育受到了抑制。另外，本研究通过免疫组织化学法检测发现，ACR暴露后仔鼠海马齿状回DCX亦显著表达减少。DCX是一种微管相关蛋白，在神经元分化、迁移过程中阶段性地表达于神经元周围的突起和胞体上，参与神经元突起的形成与发育［3］。DCX可促进微管聚合并稳定其网络结构，在神经元迁移过程中控制着神经元的聚合，稳定细胞骨架［15］。DCX表达下降，提示ACR母源性暴露可能导致仔鼠海马神经发生、分化受到抑制。有实验报道，把ACR注射到小鼠体内后，能够抑制其海马齿状回增殖活性，新生神经元减少［16］。ACR母源性暴露后，仔鼠海马齿状回GAP⁃43和DCX的表达均下降，提示ACR可能影响海马神经元的增殖、分化以及神经元轴突的延伸。ACR的神经发育毒性作用可能是多因素的，其作用机制尚有待进一步研究。

综上所述，母源性暴露后ACR能够减少仔鼠大脑GAP⁃43和DCX的表达，可能抑制了海马神经元的生长发育。而海马区与学习、记忆等高级功能密切相关，ACR母源性暴露后可能会影响到仔鼠空间学习和记忆能力发展［17］。

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