穗花杉双黄酮通过阻断丝裂原活化蛋白激酶通路抑制钛颗粒诱导的骨溶解及破骨细胞的生成

张振 禚小琪 孙钰 李小磊 张武 颜连启

1大连医科大学（辽宁大连 116044）；2苏北人民医院骨科，扬州大学临床医学院（江苏扬州225000）；3北京大学医学院第三临床学院（北京 100191）

关节置换术已成为治疗晚期骨性关节炎、老年性股骨颈骨折等疾病的不二选择，但术后并发症却一直制约着它的发展［1］。无菌性假体松动是导致翻修手术的主要并发症之一，据统计，翻修手术病例数已达同期全髋关节置换手术的20%左右［2］。目前认为假体周围产生磨屑，如聚乙烯颗粒和钛颗粒，招募免疫细胞，淋巴细胞等附着假体周围［3］，释放TNF⁃α 及 IL⁃1β等促炎性因子，促进树突状细胞、成骨细胞高表达RANKL［4］。 当 RANKL 与 RANK 结 合 时 ，激 活MAPK等信号通路促使破骨细胞生成，研究发现MAPK通路在破骨细胞的生成及骨吸收中起关键作用［5］。

然而不论是通过改进假体还是采用药物如二磷酸盐、激素替代等治疗，但由于种种不足，至今仍未能找出一个相对完美的解决措施。

穗花杉双黄酮（AMF）主要是来源于卷柏的多酚类化合物，具有促骨生成、抗炎等药效［6-7］。研究发现AMF能促进干细胞成骨及骨矿化［6］，因此猜测AMF可能能够抑制磨损颗粒诱导的骨溶解，研究发现AMF通过阻断MAPK通路起到抗炎作用［7］，MAPK是破骨细胞的生成及成熟的关键信号通路之一［5，8］。然而关于AMF对破骨细胞的作用未及报道，因此通过本实验验证AMF是否对破骨细胞介导的骨溶解起作用，为将来进步研究提供部分依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、动物、试剂健康4周龄雄性C57BL/J6小鼠24只、BABLC小鼠2只（扬州大学动物实验中心）；AMF（CAS：1617⁃53⁃4）；胎牛血清（Gaithers⁃burg，USA），0.1 U/L盘尼西林，50 μg/mL链霉素（Gibco，USA），细胞计数 Kit⁃8（碧云天，中国），RANKL和M⁃CSF（Peprotech，USA）等。

1.2 实验方法

1.2.1 模型建立24只C57BL/J6小鼠随机分为4组：对照组、钛颗粒组、低、高浓度组各6只；根据前文［9］，小鼠依次切开小鼠头皮，颅骨骨膜，除空白对照组外，其余小鼠颅骨骨膜下包埋去除内毒素的钛颗粒 30 mg［10］，依层缝合，第 2 天起对照组，钛颗粒组，低、高浓度组分别腹腔注射阿拉伯树胶（GUM），GUM，AMF⁃GUM溶液［20、40 mg/（kg·d）］，连续注射，2周后取出颅骨，行Micro⁃CT扫描。

1.2.2 Micro⁃CT扫描矢状缝与冠状缝交界区域进行放大，分析骨组织与软组织的体积比。

1.2.3 组织学分析扫描后，流动的双蒸水冲洗2 h，10%EDTA脱钙，3周后取出颅骨，包埋，切片，HE和TRAP染色。

1.2.4 BMMs分离与培养分离BABLC小鼠胫骨及股骨，剪断骨两端，冲洗骨髓细胞，红细胞裂解液裂解红细胞，收集细胞，培养箱中培养24 h后，悬浮细胞即BMMs。

1.2.5 CCK⁃8实验BMMs以1×104cells/well接种于96孔板，完全培养基（含有30 ng/mL M⁃CSF，60 ng/mL RANKL的α⁃MEM培养基）培养，24 h后不同浓度的 AMF（0、2.5、5.0、10、20、40、80、160 μmol/L）干预，72 h后加入CCK⁃8试剂，4 h后测量吸光度值。

1.2.6 TRAP染色BMMs以6×103cells/well接种于含完全培养基的96孔板，加入AMF（0、2.5、5.0、10 μmol/L），每2天换液，直至出现融合的多核破骨细胞，行TRAP染色（全程避光，保持恒温，避光染色约30 min）。

1.2.7 骨片吸收实验BMMs细胞以2.5×104cells/cm2接种于牛骨爬片上，48 h后更换完全培养基，每2天换液至第7天。超声去除骨片表面的破骨细胞，扫描电子显微镜进行扫描。

1.2.8 Western blotting实验BMMs以4×105cells/well接种于6孔板，AMF（0和10 μmol/L）预处理4 h，加入RANKL（60 ng/mL）分别刺激0、5、15、30 min和1、3、5 d，收集细胞；提取蛋白。Bradford检测蛋白浓度，恒流电泳，恒压转膜1.5 h，脱脂牛奶封闭2 h，一抗4℃隔夜孵育，二抗孵育2 h，ECL（GE，UK）检测蛋白条带。

1.3 统计学方法SPSS软件（版本16.0）分析，结果从平均值±标准差表示。P＜0.05为差异具有统计学意义，所有数据重复3次实验获得。

2 结果

2.1 AMF抑制钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解Micro⁃CT示：骨溶解经腹腔注射AMF而被抑制。钛颗粒组（Vehicle）与对照组（Sham）比较颅骨矢状缝，冠状缝间距明显增宽，可见大量的骨陷窝。而用药组骨表面可见骨愈合现象，BV/TV比值随着AMF用药浓度的增加逐渐增加（图1）。

2.2 AMF抑制体内破骨细胞的产生组织学分析示：HE染色，对照组小鼠颅骨光滑，颅骨矢状缝合紧密，而钛颗粒组颅骨表面看到显著的骨破坏，AMF组颅骨表面骨破坏得到了抑制。TRAP染色，钛颗粒组见到大量的破骨细胞，随着AMF浓度的增加，破骨细胞减少明显，高浓度组只见到少量的破骨细胞（图2）。

图1 AMF抑制钛颗粒诱导的颅骨骨溶解Fig.1 Amentoflavone can suppress titanium particles induced⁃osteolysis of mouse calvaria

注：Vehicle组，明显的钛颗粒诱导的颅骨骨溶解现象，HE结合TRAP染色，大量骨溶解导致的孔洞，周围大量的破骨细胞聚集；而随着AMF作用，骨溶解得到抑制，破骨细胞数量逐渐减少并呈现剂量依赖性

2.3 AMF所用浓度对BMMs无明显的毒性作用CCK⁃8实验示：高浓度的AMF对BMMs细胞确有毒性作用，但0～10 μmol/L的AMF对BMMs不产生明显的毒性（图3）。

图3 AMF对BMMs细胞活性的研究Fig.3 Study of amentoflavone on cell activity

2.4 AMF抑制体外破骨细胞的生成TRAP染色，0 μmol/L组可见大量的破骨细胞生成，随着AMF浓度的增加，破骨细胞的数量及体积逐渐减少，10 μmol/L组几乎看不到多核的破骨细胞（图4）。

图4 AMF抑制体外破骨细胞生成Fig.4 Amentoflavone restrain osteoclastogenesis in vitro

2.5 AMF抑制破骨细胞的功能骨片吸收实验示：0 μmol/L组骨片可见大量的深且大的骨陷窝，但随着AMF浓度的增加，骨陷窝数量逐渐减少，10 μmol/L组只看到少量的骨陷窝（图5）。

图5 AMF抑制破骨细胞功能Fig.5 Amentoflavone restrain the function of osteolcast

2.6AMF阻断MAPK通路ERK，JNK，p38蛋白磷酸化随着RANKL诱导时间的延长出现不同程度增加，而当AMF干预后，p⁃ERK、p⁃JNK、p⁃p38的表达受到了不同程度的抑制（图6 A）。NFATc1和c⁃fos随RANKL诱导时间逐渐增加，但经AMF干预后，第3、5天蛋白表达被抑制（图6）。

3 讨论

医学者一直在寻求方法来减少磨损颗粒的产生，如改良手术入路来增加术后假体稳定性，优化假体设计如三级假体，陶瓷假体等大大减少了磨损颗粒的产生［11］。然而先进的假体不但费用高昂，而且不能完全阻止磨损颗粒产生［12］。虽然抑制破骨细胞骨吸收药物，如双膦酸盐类能收到一定效果，但是肾衰竭、下颌骨坏死等严重副作用限制了此类药物的使用［13］。因此，寻找一种既能抑制破骨细胞的生成，又能减少药物不良反应的新药是很有必要的。

图6 AMF抑制MAPK信号通路及关键转录因子的表达Fig.6 Amentoflavone inhibit MAPKs and key transcription factors

研究表明AMF具有成骨作用，但是关于AMF对破骨细胞生成及骨溶解的作用是第一次研究。颅骨扫描示腹腔注射AMF能够抑制骨溶解并呈现剂量依赖性。假体周围骨溶解是破骨细胞破坏所造成的［14］，颅骨切片示AMF能够抑制破骨细胞的生成，进一步观察破骨细胞数量与颅骨骨质破坏呈现一致性。因此我们猜想AMF是通过抑制破骨细胞生成而抑制了钛颗粒诱导的骨溶解。

TRAP是破骨细胞的标记蛋白［15］，随着AMF干预剂量的增加，破骨细胞体外生成明显受到抑制。骨溶解破骨细胞是导致骨破坏的根源［14］，因此设计骨片吸收实验来验证破骨细胞的功能。实验中发现经AMF干预后骨陷窝数量及深度逐渐减少，因此推断AMF能够抑制破骨细胞的生成及功能。CCK⁃8实验示采用的AMF浓度对BMMs无明显的毒性作用，证明AMF不是通过对BMMs的毒性作用抑制了破骨细胞的生成及功能，而是通过其他作用。

研究表明MAPK信号通路在RANKL诱导破骨细胞的生成及骨吸收功能起关键作用［6，8，16］。而JNK、ERK、p38分别对破骨细胞的分化、功能及存活起着关键作用［17］。因此，猜测AMF是否通过阻断MAPK信号通路来抑制破骨细胞生成呢？研究发现RANKL介导的ERK、JNK、p38的磷酸化是短暂的［18］，实验选择AMF干预后RANKL 30 min内进行诱导。实验发现AMF能抑制RANKL介导的MAPKs相关蛋白的磷酸化。NFATc1和 c⁃fos是MAPK通路介导破骨细胞生成重要的转录因子［19-20］。经AMF干预后，NFATc1和c⁃fos蛋白的表达受到了不同程度的抑制，说明AMF可能通过抑制NFATc1和c⁃fos的表达阻断MAPK信号通路。以上结果说明AMF能够阻断MAPK信号通路。综上，笔者认为AMF可能是通过阻断MAPK通路抑制破骨细胞的生成及钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解。

本研究不足。未设立阳性对照组来验证AMF的确切功效；实验采用的是工业颗粒，与人体内的颗粒大小及数量很难模拟。

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