糖皮质激素环境下骨重塑相关细胞外泌体miRNA变化

李 毅，尹鹏滨，邓 元，孟钰童，吕厚辰，张里程，唐佩福解放军总医院，北京 100853

糖皮质激素类药物目前应用广泛，其在炎症性疾病和自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要作用。然而长期、大剂量应用糖皮质激素类药物会导致多种骨相关疾病如骨质疏松、骨坏死等[1-2]。既往研究发现，糖皮质激素能够通过影响成骨细胞和破骨细胞活性从而打破骨代谢平衡，最终导致骨量丢失[3-4]。有研究指出糖皮质激素能够改变骨代谢相关miRNA的表达，从而引起骨细胞的增殖、凋亡等改变[5]。Shi等[6]发现过表达的miR-199a通过偶联WNT信号通路能够增强糖皮质激素对成骨细胞增殖的抑制作用。Li等[7]发现糖皮质激素刺激后的间充质干细胞在成骨分化过程中miRNA的表达会发生变化，其中9种miRNA表达上调，7种miRNA表达下调。有研究报道成骨细胞表达的miR-17/20a能够抑制糖皮质激素对破骨细胞分化的诱导作用[8]。以上研究提示糖皮质激素能够改变骨相关细胞miRNA的表达，进而对骨代谢过程产生影响，然而其具体机制仍然不明确。近年来，外泌体(exosome)因广泛参与疾病病理生理过程而成为研究热点。外泌体是一种纳米级别的囊泡，可由机体的多种细胞分泌，且广泛分布于唾液、血浆、血清、尿液、乳汁等体液中，其内部包裹了蛋白质、mRNA、miRNAs、细胞因子等物质[9-12]。有研究发现，血浆及血清中的miRNAs主要来源于外泌体，而外泌体可以保护循环miRNAs，使得miRNAs不被RNA酶降解[13-14]。外泌体源性miRNAs具有调节细胞间通讯的重要功能，是疾病发生发展的重要环节[15-17]。本研究通过用不同浓度地塞米松刺激骨相关细胞后提取其分泌的外泌体，对外泌体内miRNA变化进行检测，探索糖皮质激素对外泌体源性miRNA的调节作用，为糖皮质激素对骨代谢机制的影响提供新的思路。

材料和方法

1 主要试剂和药品 DMEM培养液、αMEM培养液、青霉素/链霉素双抗溶液、胎牛血清(Gibco公司)；地塞米松、胰蛋白酶(Sigma公司)；CCK-8试剂盒(Dojindo)；MC-3T3-E1细胞株、RAW264.7细胞株(解放军总医院骨科研究所)；细胞外囊泡(外泌体)分离柱(Izon公司)；超滤管(millipore公司)。

2 MC-ETE-E1细胞培养 将MC-3T3-E1细胞株复苏后使用含10%胎牛血清，青链霉素双抗αMEM培养基作为MC-ETE-E1细胞的培养液，于37℃、5% CO2细胞培养箱内常规培养，每48 h换液1次，待细胞增殖到培养皿面积80%时可进行传代。

3 RAW264.7细胞培养 将RAW264.7细胞复苏后使用10%胎牛血清，青链霉素双抗DMEM培养基，于37℃、5% CO2环境进行培养，每天观察细胞生长情况，待细胞增殖到培养皿面积80%时可进行传代。

4 细胞外泌体 提取采用无外泌体血清配制细胞所需培养基，常规培养48 h后收集细胞上清，4℃条件下2 000×g离心10 min、12 000×g离心45 min取上清，110 000×g离心2 h，取沉淀用1 ml PBS重悬，经0.22μm孔滤器过滤后，110 000×g离心70 min，弃上清后用1 ml PBS重悬，110 000×g离心70 min，弃上清后用1 ml PBS重悬沉淀后-80℃保存。

5 外泌体内RNA提取 向含有外泌体的EP管中加入1 ml TriZol，做好标记后置于冰盒中。将EP管简单离心，反复摇晃、震荡，冰盒中孵育0.5 h，以有利于RNA与核糖体完全分离。向EP管中加入0.2 ml氯仿，盖好离心管，剧烈摇晃2 min后室温孵育10 min。4℃，12 000 r/min，离心15 min。取500μl上层水相转移至新的EP管中，EP管置于

插板中，向EP管中加入500μl异丙醇，简单离心，摇晃混匀并室温孵育10 min。4℃，12 000 r/min，离心10 min。弃上清，加入1 ml 75%乙醇，将沉淀从管壁上洗涤下来。4℃，7 400 r/min，离心5 min。弃上清，室温干燥10 min，加入15 μl DEPC水，简单离心，之后-80℃保存。

6 CCK-8测定细胞活性 将MC-ETE-E1与RAW 264.7分别以2×104/孔的细胞密度接种于96孔板培养24 h，分4组，每组设5个复孔，4组分别为1μg/ml DEX、10μg/ml DEX、100μg/ml DEX 以及空白对照组(加PBS溶液补足体积)，37℃，5%CO2常规培养，利用CCK-8实验检测细胞活性。

7 外泌体表型鉴定 1)透射电镜观察：将获得的外泌体加入4%多聚甲醛溶液中，固定后吸取适量滴至透射电镜铜网上，PBS清洗铜网8次，加入1%戊二醛固定5 min，蒸馏水清洗2次后采用0.4%醋酸双氧铀将样品染色5 min，室温干燥30 min后采用透射电镜在120 kV下观察并拍照。2)外泌体颗粒直径分析：取外泌体10μl加90μl PBS，充分吹打混匀后，加入粒径分析仪中进行测定。3)外泌体CD9、CD81 Western blot鉴定：BCA测定外泌体蛋白浓度，取30μg上述外泌体蛋白样品经SDS-PAGE电泳2 h，100 V电压下100 min转至PVDF膜。5%脱脂牛奶常温封闭1 h后，分别孵育相应的一抗4℃过夜(CD81抗体，l∶100稀释；CD9抗体，1：100稀释)。采用PBST洗涤5 min×3次，二抗常温孵育1 h，PBST洗涤5 min×3次，ECL法显色，凝胶成像系统拍照。

8 RT-qPCR检测外泌体内miRNA表达 1)将逆转录引物(miR-133、miR-214、miR-4697和miR-487)简单离心震荡混匀，置于70℃水浴锅中，预变性5 min，然后置于冰上2 min，作为反应体系。2)将所提取的MC-3T3-E1和RAW264.7细胞外泌体内RNA加入反应体系，每组加入8.4 μl配置好的RT-Mix。3)设置反转录程序，退火温度25℃，时间5 min，延伸42℃，时间60 min，失活70℃，时间15 min，之后开始进行PCR扩增，PCR体系中各组分体积：Temple cDNA 2μl、Sense+Antisense(10μmol/L) 2 μl、Bestar qPCR MasterMix 10 μl、ddH2O 6μl，PCR反应程序设置：预变性95℃，2 min，变性95℃，10 s，退火/延伸60℃，30 s，72℃，30 s，95℃，1 min，进行40个循环融解曲线分析60℃，1 min。

9 统计学分析 统计学分析应用SPSS19.0软件、GraphPad Prism 6软件完成，数据以-x±s表示，组间比较采用方差分析，事后检验采用SNK法；P＜0.05差异为有统计学意义。

结 果

1 不同浓度地塞米松刺激下成破骨细胞活力变化从图1中可以看出不同浓度地塞米松均能够抑制MC-3T3-E1的增殖，且随着地塞米松浓度增加其抑制作用逐渐增强。地塞米松对RAW264.7增殖具有抑制作用，高浓度地塞米松(100μg/ml)抑制作用较低浓度地塞米松(1μg/ml，10μg/ml)强(P＜0.05)。以上结果提示地塞米松对成骨细胞和破骨细胞均具有抑制作用，且程度有所不同。

2 外泌体表型鉴定 透射电镜下外泌体呈现典型杯口状形态(图2A)，外泌体平均粒径大多为100 nm(图2B)，所获得的纳米粒子复合外泌体范围。CD9、CD81为囊泡表面跨膜蛋白，Western blot结果显示MC-3T3-E1与RAW264.7两种细胞外泌体均表达CD9和CD81(图2C)，证实了提取物确实是外泌体。

3 不同浓度地塞米松刺激后外泌体内miRNA的变化 qRT-PCR检测显示(图3)地塞米松会降低成骨细胞外泌体内miR-133、miR-214、miR-4697的含量，且随着地塞米松浓度增加miRNA含量递减；低剂量地塞米松能够增加miR-487含量，而高剂量时miR-487含量显著下降(P＜0.05)。对于破骨细胞，相比于空白对照组，1μg/ml地塞米松能够显著增加外泌体内miR-133、miR-214、miR-487和miR-4697的含量(P＜0.05)，而在10μg/ml时4种miRNA均降低到空白对照组水平以下，

100μg/ml时 miR-214含量上升明显(P＜0.05)，而miR-133、miR-487、miR-4697含量无显著变化(P＞0.05)。由此我们推测地塞米松会影响成骨细胞和破骨细胞分泌外泌体内miRNA含量，可能产生了骨重塑的调节。

讨 论

近年来，外泌体在骨科疾病中的作用越来越受关注。Cui等[18]研究发现，矿化的成骨细胞分泌的外泌体能够进一步促进成骨细胞的矿化，且成骨细胞内的miRNAs表达谱发生显著改变，由此激活Wnt信号通路来促进间充质干细胞的成骨分化。不仅成骨细胞外泌体能够调控骨代谢，有研究表明破骨细胞来源的外泌体也能够通过调节miR-214-3p的表达进而抑制成骨过程[19]。Huynh等[20]研究表明，破骨细胞前体细胞来源的外泌体能促进破骨生成，而成熟破骨细胞来源的外泌体却抑制破骨生成。破骨前体细胞来源的外泌体可能是破骨骨吸收作用的重要调节剂，而外泌体传递的RANK蛋白可能是调节骨吸收作用的关键环节。随着研究的不断深入，外泌体对糖皮质激素导致的骨相关疾病的研究也逐渐丰富。有研究者发现滑膜间充质干细胞来源的外泌体对激素诱导性股骨头坏死具有治疗作用，滑膜间充质干细胞源性外泌体能够在体外促进间充质干细胞的增殖并能够抗凋亡，体内研究表明外泌体能够对股骨头产生保护作用[21]。另有研究发现IPS诱导的间充质干细胞来源外泌体也有相似的保护作用[22]。血小板富集的外泌体能够通过Akt/Bad/Bcl-2信号通路抑制股骨头骨坏死进程，抑制糖皮质激素对间充质干细胞、成骨细胞和血管内皮细胞的促凋亡作用[23]。然而外泌体在糖皮质激素对骨代谢影响过程中的作用机制仍然不明确。

本研究通过用不同浓度地塞米松刺激成骨细胞和破骨细胞，提取分泌的外泌体，发现地塞米松可导致成骨细胞和破骨细胞分泌的外泌体内miRNA表达产生变化，说明外泌体可能是地塞米松作用于骨代谢的一个重要中间环节。我们的前期研究发现，在骨质疏松人群外周血外泌体内miR-133、miR-214、miR-487和miR-4697的表达有显著差异，而既往研究已证实外泌体来源miR-214广泛参与骨形成和骨吸收过程[19,24]，miR-133参与调节间充质干细胞成骨分化过程[25]，以上提示我们这4种miRNA可能与骨代谢过程密切相关。本研究结果显示，地塞米松刺激能够降低成骨细胞内miR-133、miR-214、miR-4697的含量，且随着地塞米松浓度增加miRNA含量递减；低剂量地塞米松能够增加miR-487含量，而高剂量时miR-487含量会显著下降。地塞米松刺激破骨细胞后，低剂量地塞米松(1μg/ml)能够显著提高外泌体内 miR-133、miR-214、miR-487和 miR-4697的含量(P＜0.05)，而在10μg/ml时4种miRNA均降低到空白对照组水平以下，100μg/ml时miR-214含量上升明显，而miR-133、miR-487、miR-4697含量无显著变化。以上结果提示我们这4种miRNA参与了地塞米松影响骨生成和骨吸收过程，但仍然需要进一步研究揭示其具体的作用机制。

目前外泌体在骨组织中作用的研究还处于初始阶段，随着对外泌体研究的深入，其对靶细胞间的信号机制会更加明确，对疾病诊断和寻找治疗新靶点具有重要的临床意义。

图 1 不同浓度地塞米松环境下成破骨细胞活力变化 A： 地塞米松对成骨细胞增殖影响； B： 地塞米松对破骨细胞增殖影响Fig. 1 Effect of dexamethasone on the viability of osteoblasts and osteoclasts A: Dexamethasone at different concentrations on the viability of osteoblasts; B: Dexamethasone at different concentrations on the viability of osteoclasts

图 2 外泌体表型鉴定 A： 透射电镜下外泌体； B： 外泌体粒径分布图； C： Western blot外泌体表面标记鉴定(CD9、CD81);左为成骨细胞来源外泌体，右为破骨细胞来源外泌体Fig. 2 Characterization of exosomes A: Morphology of exosomes under a transmission electron microscopy (Scale bar: 100 nm); B: Particle size distribution of exosomes; C: Western blott analysis of exosomal surface markers (including CD9 and CD81); Left for osteoblastderived exosomes, right for osteoclast-derived exosomes

图 3 不同浓度地塞米松刺激后外泌体内miRNA的变化 A： 成骨细胞外泌体内miRNA含量变化； B： 破骨细胞外泌体内miRNA含量变化Fig. 3 Effect of dexamethasone on exosomal miRNAs derived from osteoblasts and osteoclasts A: Changes of content of miRNAs in osteoblast exosomes; B: Changes of content of miRNAs in osteoclast exosomes

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