神经病理性疼痛大鼠中脑导水管周围灰质腹外侧区GABAAα1受体的表达变化

孙万秋，王桂芝， 冀玉萍，李 军

潍坊医学院 麻醉学系，山东潍坊 261053

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是一种以痛觉过敏、痛觉超敏、自发痛及感觉异常为特点的慢性病理性疼痛[1-2]。通常其形成原因复杂多样，疼痛程度难以忍受，临床治疗效果欠佳，严重影响患者的工作生活质量。导致NP的原因包括组织损伤、感染、药物毒素、外周神经损伤等，但其发病机制尚未完全阐明。NP的发病机制之一是突触前抑制的减弱[3]，而抑制性神经递质γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA)主要是借助γ-氨基丁酸A受体(γ-aminobutyric acid type A receptor，GABAAR)来实现在疼痛传导中的作用。目前已有研究表明NP大鼠内侧额叶前皮质GABAAα1受体表达上调可能参与了NP的形成与维持[4]，但NP大鼠中脑导水管周围灰质腹外侧区(ventrolateral periaqueductal gray，vLPAG)GABAAα1受体是否参与NP的表达尚未见报道。本研究旨在探讨GABAAα1受体在NP大鼠vLPAG表达变化及其是否参与NP表达过程，为NP的治疗提供新的思路。

材料和方法

1 实验动物及分组 清洁级成年雄SD大鼠15只，体质量240 ～ 280 g，由青岛派特福德白鼠养殖专业合作社提供。大鼠在安静、温暖、70%湿度的环境中饲养1周，随机分为空白对照组(C组)、假手术组(S组)、神经病理性疼痛模型组(NP组)，每组5只。所有大鼠在造模前测基础痛阈，剔除痛觉异常大鼠。

2 主要试剂与仪器 兔抗大鼠GAPDH和山羊抗兔IgG(Wanleibio)，兔抗大鼠GABAAα1受体抗体(AbSci)，Eppendorf台式高速冷冻离心机，天能5200化学发光检测系统，天能EPS300电泳系统。

3 坐骨神经分支选择性损伤模型建立 采用Decosterd和Woolf[5]建立的坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury，SNI)模型，采用20%水合氯醛(0.2 ml/100 g腹腔注射)对大鼠进行麻醉，右侧卧位固定于手术台板上，备皮，消毒，顺肢体方向，沿坐骨神经分叉处切开皮肤，钝性分离肌肉，充分暴露并游离出坐骨神经及其远心端分支：内侧胫神经、中间腓总神经和外侧腓肠神经，用4-0号丝线分别结扎胫神经与腓总神经并于远心端切断，术中轻柔操作，避免牵拉腓肠神经，确保完好无损，结扎完成后逐层缝合肌层和皮肤，缝合前涂抹肌注青霉素预防术后感染。假手术组只暴露游离神经，不结扎切断，余操作相同。

4 大鼠机械缩足反射阈值测定 机械缩足反射阈值 (paw withdrawal mechanical threshold，PWMT)采用Dixon的Up-Down方法[6]，分别于术前1 d、术后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d上午10：00测定大鼠PWMT。采用不同强度(0.4 g、0.6 g、1.0 g、2.0 g、4.0 g、6.0 g、8.0 g、10.0 g) Von Frey丝测定 PWMT。以2.0 g开始，刺激大鼠足外侧区域，测试时纤维丝呈S状停留约5 s，间隔30 s，测5次，若5次中3次出现快速缩足或舔爪行为，记为“X”，则选用相邻刺激递减纤维丝继续操作；反之则记为“O”，选择相邻刺激递增纤维丝继续刺激，如此操作，出现第一个“X”后继续测量5次，或者为5个字符的OOOOO和4个字符的XXXX，查表并利用公式换算得到PWMT。

5 GABAAα1受体表达水平检测 建模后14 d检测PWMT后，麻醉大鼠，打开胸腔，灌注冲洗后断头处死，参照大鼠脑立体定位图谱(第6版)快速切取vLPAG，提取脑蛋白组织。BCA法测定总蛋白浓度，电泳分离并转膜，牛奶封闭液室温下封闭2 h，分别加兔抗大鼠GABAAα1一抗溶液(1∶1 000)和抗大鼠GAPDH(1∶2 000)，4℃环境中孵育过夜，TBST清洗后，加HRP标记的山羊抗兔二抗溶液(1∶3 000)室温孵育2 h，再次TBST及TBS清洗后，使用天能5200发光检测系统显影并拍摄图像，采用IPP6.0分析图像，根据IOD值计算GABAAα1表达产物与GAPDH产物灰度比值，以此比值反映GABAAα1受体的相对表达水平。

6 统计学分析 采用SPSS20.0统计软件，计量资料为多时点观测计量资料，以±s表示，两组比较行两因素重复测量方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠PWMT变化 与C组大鼠各时相机械缩足反射阈值比较，S组大鼠无明显改变；NP组大鼠术后第1天机械缩足反射阈值为0.907±0.251 g，明显低于S组(8.216±1.428 g)，并在后期呈持续性降低(P＜0.05)。各组大鼠PWMT比较见图1。

2 GABAAα1受体相对表达量变化 大鼠中脑导水管周围灰质腹外侧区处γ-氨基丁酸A受体α1受体蛋白表达水平为0.699±0.027，较C组(0.636±0.023)无明显差异。NP组大鼠中脑导水管周围灰质腹外侧区处γ-氨基丁酸A受体α1受体蛋白相对表达量为1.442±0.015，明显高于S组(0.699±0.027)(P＜0.05)。各组大鼠GABAAα1受体相对表达量的比较见图2。

图 1 各组大鼠PWMT变化(n=5)Fig.1 Changes of PWMT in rats in each group (n=5) ( aP＜0.05, vs group S; bP＜0.05, vs 0 d)

图 2 各组大鼠GABAAα1受体表达量的变化(n=5)Fig. 2 Changes of GABAAα1 receptor expression in rats in each group (n=5) ( aP＜0.05, vs group S)

讨 论

目前神经源性疼痛动物模型较多，包括慢性坐骨神经压迫模型、脊神经结扎(spinal nerve ligation，SNL)模型以及SNI模型等[7]，其中SNI模型是NP的常用模型之一，其具有机械痛敏感、神经损伤程度可判断、模型制作重复性高、产生行为学可维持6个月之久、最接近于临床NP的特点[5]。本研究中，NP组大鼠术后出现手术足外翻畸形、自发性缩足舔爪等疼痛学行为，且机械痛阈持续下降，并维持整个观察阶段。这些特征都与Woolf建立的SNI模型一致。

以往关于GABAA受体在NP中作用的相关研究集中于脊髓水平，而在中脑水平方面的研究报道较少。据报道，PAG在SNL大鼠疼痛传导过程中发挥重要作用[8]，是痛觉信号传递过程中一个承上启下的重要结构，它既接受脊髓的痛觉传入[9]，将其投射至丘脑核团，处理上行的痛觉反应，也可以通过延髓腹内侧核投射通路下行调节痛觉反应。下行调节系统的关键位置即vLPAG和脑干嘴端腹内侧髓质区[10]。在NP大鼠vLPAG放置可以刺激神经的电极进行深部脑刺激有不错的镇痛效果[11]。GABAA受体是一种主要存在于中枢神经系统的抑制性离子型受体，GABAA受体复合物的组装及功能可能与GABAA受体α亚单位有关[12]，此外GABA能神经亚群参与中脑导水管周围灰质的感受调节[13]。本研究组前期的研究表明，GABAA受体α亚单位可能参与急性疼痛在中脑导水管周围灰质腹外侧区的传导过程[14]。这些研究可以帮助我们推测GABAAα1是否参与vLPAG对神经病理性疼痛传导的调节机制。

本研究发现，大鼠SNI造模后机械痛阈降低，并持续整个观察阶段，Western blotting结果显示，中脑导水管周围灰质腹外侧区GABAAα1蛋白相对表达量在造模后上调，这可能是GABAAα1受体参与中脑水平的疼痛调节机制所致。有研究发现CCI大鼠GABAAα2表达改变与脊髓疼痛传导有关[15-16]，GABAAα1信使核糖核酸已被发现在硝酸甘油偏头痛大鼠模型中发挥作用[17]；GABAAα5也被证明对NP形成有重要作用[18]，这些研究表明GABAA受体α亚单位在疼痛模型中发挥重要作用。但NP大鼠vLPAG GABAAα1受体的改变趋势仍缺少研究支持，因此通过本研究可推测GABAAα1受体可能参与vLPAG对NP传导的调节机制。

综上所述，神经病理性疼痛大鼠中脑导水管周围灰质腹外侧区GABAAα1表达上调，可能参与vLPAG对神经病理性疼痛传导的调节机制，但具体机制仍有待进一步研究。

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