EB和CVA患者诱导痰黏蛋白水平分析及其差异机制

林雪芬 陈裕光 温武金 洪阿体

深圳市宝安第二集团总医院内二科，广东深圳 518104

嗜酸粒细胞性支气管炎（eosinophilic bronchitis，EB）是一种以嗜酸性粒细胞为主的多种炎性细胞浸润为特征的慢性气道炎症疾病[1]，临床表现以刺激性干咳为主，细胞学检查显示患者痰液嗜酸性粒细胞增高且合并病理性痰液增多。一项前瞻性研究表明[2]，EB占我国慢性咳嗽病因的22%，仅次于咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）和上气道咳嗽综合征。MUC5AC是气道黏液中最重要的黏痰白，表达于正常气道上皮的杯状细胞内，具有保护和润滑上皮，防御外来刺激物及阻止病原菌入侵等作用[3]。研究显示[4]，EB与CVA均具有相似的嗜酸粒细胞性气道炎症，但EB患者病理性痰液增多的比例与黏痰白水平的类型及机制尚不清楚。本研究旨在通过观察EB和CVA患者诱导痰中气道黏痰白MUC5AC、MAC5B及炎症因子的表达水平，分析EB缺乏黏液高分泌的机制，现报道如下。

表1 三组患者一般资料比较

表2 三组患者黏蛋白水平与炎症介质比较（±s）

表2 三组患者黏蛋白水平与炎症介质比较（±s）

注：与其他两组比较，*P＜0.05

组别 n MUC5AC（μg/mL） MUC5B（μg/mL） LTC4（pg/mL） PGE2（pg/mL）EB组 20 16.4±6.9 2.7±0.4 311.8±88.5 424.7±127.2*CVA组 20 25.7±8.6* 1.3±0.7* 701.6±163.4* 152.6±65.4对照组 20 13.7±5.2 2.4±0.4 89.3±15.2 122.4±19.2 F 16.000 40.247 165.798 79.871 P 0.000 0.000 0.000 0.000

1 资料与方法

1.1 一般资料

我院2016年10月～2017年4月门诊嗜酸粒细胞性支气管炎病例20例，符合中华医学会呼吸病学分会制定的《咳嗽诊断与治疗指南（2015）》的EB诊断标准[5]，男14例，女6例，年龄21～52岁，平均（43.4±3.9）岁。咳嗽变异性哮喘患者20例，符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组制定的《咳嗽变异性哮喘防治指南（2016年版）》的诊断标准[6]，且处于缓解期的轻、中度患者，男13例，女7例，年龄24～58岁，平均（43.2±4.7）岁。健康对照组，体格检查正常，血常规、胸部X片正常、肺功能正常，非吸烟者，无过敏体质或慢性呼吸系统疾病。三组患者在性别、年龄等一般资料上比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

1.2 方法

（1）EB、CVA及健康体检者于入组后第一天行肺功能检测，高渗盐水雾化诱导痰，而后进行痰细胞分类及上清黏蛋白与炎症介质测定；（2）诱导痰及痰液处理方法：首先给予受试者沙丁胺醇气雾剂（山东京卫制药有限公司，H37022817，200揿，0.10mg/揿）400μg吸入，10min后清水漱口，擤鼻；而后行3%浓度高渗盐水雾化吸入20min，漱口，将唾液吐干净后，嘱患者用力深咳，咳出痰液至消毒器皿中，而后继续雾化至结束。痰标本处理：用平口镊取出痰液中粘稠部分，放入EP管中，加入4倍体积的0.1%DTT，漩涡震荡1min，充分混匀后，37℃水浴10min，采用200目筛网过滤杂质，2500r/min离心10min，取上清液放置于-80℃恒温箱内待检。制作细胞涂片，HE染色，光镜下进行400个上皮细胞分类；采用ELISA法测定痰液中MUC5AC、 MUC5B及炎症介质白三烯C4（leukotrienes C4，LTC4）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2），黏蛋白试剂盒购自美国CUSABIO 公司，炎症介质试剂盒购自CVAyman 公司，严格按照操作规范进行；（3）肺功能检测：严格按照中华医学会呼吸病学分会肺功能专业组制定的《肺功能检查指南》[7]进行肺功能检测，采用德国 Jaeger Mastercope 肺功能仪进行支气管激发试验，由同一操作技师进行。

1.3 评价指标

黏蛋白MUC5AC、MUC5B；炎症介质LTC4、PGE2；痰细胞分类：细胞总数（total cell count，TCC）、嗜中性粒细胞比例（neutrophils，Neu）、嗜酸性粒细胞比例（eosinophils，EOS）、淋巴细胞比例（lymphocytes，Lym）。

1.4 统计学处理

采用统计学软件SPSS19.0版对数据进行统计分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间比较采用LSD检验；相关性分析采用Pearson线性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者黏蛋白水平与炎症介质比较

CVA组MUC5AC水平明显高于EB组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CVA组MUC5B水平明显低于EB组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；CVA组LTC4水平明显高于其他两组，EB组PGE2水平明显高其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2 三组患者诱导痰细胞学分类比较

CVA组细胞总数、中性粒细胞百分比、嗜酸粒细胞百分比明显高于其他两组，EB组细胞总数、中性粒细胞百分比、嗜酸粒细胞百分比明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 三组患者诱导痰细胞学分类比较（±s）

表3 三组患者诱导痰细胞学分类比较（±s）

注：与其他两组比较，#P＜0.05，与对照组比较，*P＜0.05

组别 n TCC（106/g） Neu（%） EOS（%） Lym（%）EB组 20 2.7±0.8 27.4±12.8* 14.7±10.9* 1.3±1.1 CVA组 20 3.3±0.9# 37.1±18.7# 48.5±21.1# 1.2±0.7对照组 20 1.7±0.4 13.8±3.3 0.3±0.1 1.7±0.9 F 24.348 15.673 65.121 1.673 P 0.000 0.000 0.000 0.197

2.3 相关性分析

MUC5AC水平与EOS、LTC4呈正相关（r=0.771，0.864，P＜0.01）；MUC5B水平与PGE2呈正相关（r=0.692，P ＜ 0.05）。

3 讨论

慢性气道炎症中气道黏液水平升高是一项重要的病例特征[8]。在正常人群中，气道黏液是重要的防御屏障，能够抵御外界病原菌入侵和中和过敏原作用[9]。当气道内黏液水平过度升高时，会引发气道呈高反应状态，加重气道炎症，影响患者生命健康。气道黏液主要由气道杯状细胞和黏膜下腺体合成的黏蛋白、水和电解质组成，黏蛋白的主要组成成分是MUC5AC与MUC5B，研究显示[10]，在CVA患者中MUC5AC水平明显增高，且有证据显示其与哮喘严重程度呈正相关，但尚无确切报道证实MUC5B与哮喘严重程度存在相关性；另外，EB与CVA均具有相似的嗜酸粒细胞性气道炎症，但EB患者病理性痰液增多的比例与黏痰白水平的类型及机制尚不清楚。动物实验表明[11]，在人工建立小鼠哮喘模型中，小鼠受到抗原激发后，MUC5B水平可无变化或轻度升高。研究EB与CVA患者中诱导痰黏蛋白水平差异及分析其影响机制对于更加针对性的治疗慢性气道炎症具有重要意义。

本研究结果提示，CVA组MUC5AC水平明显高于EB组和对照组，MUC5B水平明显低于EB组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），进一步证实了MUC5AC在诱导痰黏液高分泌中的作用，但从表2看，EB组MUC5AC高于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05），罗炜等[12]调查问卷发现，近10%的EB患者存在一定程度的黏液高分泌现象，这在一定程度上解释了本研究的结果。三组炎症因子对比结果提示，CVA组LTC4水平明显高于其他两组，EB组PGE2水平明显高其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）；相关性分析也得出MUC5AC水平与 EOS、LTC4呈正相关（r=0.771，0.864，P＜0.01）；MUC5B水平与PGE2呈正相关（r=0.692，P＜0.05）；证实嗜酸性粒细胞在气道炎症的高黏液分泌中扮演着重要角色，至于炎症因子与黏蛋白的关系，国内研究表明[13-14]，采用PCR技术诱导痰细胞因子mMRNA表达，发现CVA和EB患者诱导痰细胞IL-5、IL-4、IL-10表达无差异，但EB组诱导痰中前列腺素E2（PGE2）水平显著高于CVA组，与本研究结果一致；另外王娇莉等[15]在研究EB与CVA患者气道炎症细胞与炎症介质的特征中发现EB组患者诱导痰中PGE 2水平明显高于CVA组，另外，EB 患者诱导痰中LTC 4 水平无明显增高，其认为这可以部分解释EB患者无气道高反应的原因。

综上所述，EB和CVA患者诱导痰黏蛋白水平存在明显差异，而炎症因子比例失衡与嗜酸粒细胞比例不同可能是引起EB缺乏黏液高分泌的机制。但本研究样本量有限，对于嗜酸性细胞在调节黏蛋白水平的机制方面有待进一步研究。

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