基于高分辨率熔解曲线分析技术鉴别杭白菊和黄山贡菊的初步研究

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(浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018)

0 引 言

高分辨率熔解曲线(High resolution melting， HRM)是一种分辨率高、简单高效的DNA检测技术，分辨精度可以区分单个碱基差异；HRM技术原理基于DNA序列因片段长度、GC含量、GC分布的不同，在PCR过程中加热变性时会产生特有的熔解曲线形状与位置[1]。HRM利用饱和染料结合实时荧光定量PCR，对PCR反应产物进行分析，实时监测核苷酸双链熔解过程荧光信号的积累，获得高分辨率熔解曲线，监测双链熔解随温度变化产生的曲线，可直观地反映PCR产物的差异，进行PCR熔解曲线分析[1]。HRM作为一种新型的分子诊断技术，具有高通量、低成本、简单直观等优点，在中药真伪鉴定中应用广泛[2-5]。陈康等[6]利用熔解曲线分析技术扩增鹿茸药材的DNA条形码COⅠ序列，通过比较熔解曲线峰形和Tm位置来鉴别马鹿、梅花鹿及其混伪品，建立正品鹿茸药材熔解曲线模型。胡峻等[7]对木通类药材进行了基于DNA条形码序列的高分辨率熔解曲线分析，建立了通过比较熔解曲线和Tm位置鉴别不同来源木通类药材的检测方法。高分辨率熔解曲线分析技术通过监控荧光定量PCR过程产生的熔解曲线变化进行分析，是物质分类和鉴定的新技术，在中药分子鉴定中具有广泛应用前景[8]。

菊花(Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.)作为药食同源的一种药材，既可入药，也可做茶[9]。中药菊花是取用菊科植物头状花序经干燥加工而成，菊花品类众多，2015版《中华人民共和国药典》收录亳菊、滁菊、贡菊、杭菊和怀菊[10]。其中杭菊和贡菊是药茶两用、茶用为主的品类，种植生产较多，且两者种质相近[11]。杭菊又分为杭白菊和杭黄菊。杭白菊原产自浙江桐乡，为著名的“浙八味”之一，贡菊主产于安徽歙县，并覆盖黄山市。两者虽同为药茶两用菊花，但在保健功效、药用成分及药理方面各有不同，饮用或入药时需加以区分[12]。

传统鉴别菊花的方法主要包括性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定等，但是传统方法主观性强，往往难以精确区分[13-16]。DNA条形码技术利用可作为物种鉴定的序列标签进行生物物种分类和鉴定，广泛应用于各类物种鉴定，同时也被应用到中药材鉴定研究中[17]。DNA条形码技术鉴定中药材不依赖于药材外观形态，该方法用于鉴定中药材与其常见混伪品，具有客观、稳定、重复性强的特点，弥补传统鉴定方法的不足[5]。用于中药材鉴定的DNA条形码序列主要包括ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL等。其中，ITS2是真核生物rDNA上的一段高度重复的串联结构单位，在种属水平的变异较为明显，具有更多的突变位点以便于区分鉴别不同的种属[18]。

本文选用ITS2序列作为DNA条形码标记，采用高分辨率熔解曲线分析技术，对杭白菊及黄山贡菊进行基于ITS2的熔解曲线分析，建立利用高分辨率熔解曲线分析技术鉴别杭白菊和黄山贡菊的方法。

1 材料与方法

1.1 药材材料

菊花对照样品，购自中国食品药品检定研究院，杭白菊和黄山贡菊市售药材样本共计10个，具体见表1。

表1 药用菊花样品及来源

1.2 DNA提取

取杭白菊和贡菊样品各200 mg，液氮研磨成粉状，参照(磁珠法)深加工产品基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程公司)的方法提取药材样品的总基因组DNA，取5.0 μL DNA经1%琼脂糖凝胶电泳对样本进行质量检测，并经微量紫外可见分光光度计测定DNA的纯度和浓度。将所提取DNA样品调整至10.0 ng/μL作为模板用于熔解曲线分析。

1.3 PCR扩增与高分辨率熔解曲线分析

ITS2序列的PCR扩增和高分辨率熔解曲线分析在Light Cycler 480 Ⅱ仪器(Roche， 德国)进行。序列引物使用ITS2通用引物(ITS3-F: ATGCGAT

ACTTGGTGTGAAT; ITS2-R: GACGCTTCTCC

AGACTACAAT)，由英潍捷公司合成。反应体系为：2×Green-2-Go Master mix 5.0 μL(BBI公司)、引物(10 μmol/L)各0.4 μL、模板DNA 1.0 μL、RNase free H2O补充总体积到10.0 μL。PCR及熔解曲线程序为：95℃预变性5 min；95 ℃变性30s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。扩增结束后进行熔解曲线分析，反应条件为95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲线数据收集从65 ℃到95 ℃，温度上升速率为1 ℃/s。

1.4 检测结果对比分析

分别取杭白菊与黄山贡菊样品的PCR扩增产物进行测序，并结合样品序列与高分辨率熔解曲线检测结果对比分析，验证高分辨率熔解曲线分析技术的检测结果。

2 结果与分析

2.1 提取的DNA质量分析

紫外分光光度计法测得所提取样品DNA质量浓度为50.22～112.42 ng/μL，A260/A280均在1.8左右。凝胶电泳检测结果(图1所示)显示所提取DNA稍有降解，基因组DNA条带清晰。说明样品DNA质量良好，可用于后续的PCR及HRM分析。

M：DNA Ladder；1—5：杭白菊样品；6—10：黄山贡菊；11：菊花对照品图1 杭白菊及黄山贡菊DNA琼脂糖凝胶电泳检测图

2.2 PCR扩增与熔解曲线分析

以浓度为10 ng/μL的杭白菊及贡菊DNA为模板，PCR扩增ITS2序列。电泳检测结果如图2。杭白菊及黄山贡菊的PCR产物长度在400～500 bp之间，符合预期。

M：DNA Ladder；1—5：杭白菊样品；6—10：黄山贡菊样品；11：菊花对照品图2 杭白菊及黄山贡菊PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图

PCR产物进行HRM分析，以Tm值为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，获得标准化的熔解曲线，结果如图3，可见杭白菊和黄山贡菊的熔解曲线都表现出不同的形状特点。10份样品的标准化熔解曲线聚类分成两束，其中菊花对照样品与5条杭白菊的熔解曲线聚为一束，5条黄山贡菊的熔解曲线聚为一束。从标准化的熔解曲线图中可以明确区分杭白菊与黄山贡菊。

a：杭白菊；b：黄山贡菊；c:菊花对照品图3 标准化的随温度变化的高分辨率熔解曲线

以菊花对照品为参照做基线，与其他样品产生相对荧光值的差值为纵坐标生成衍生熔解曲线差异图(图4所示)。5条杭白菊差异曲线成束聚与基线附近，5条黄山贡菊差异曲线线形一致且成束分布与基线上方。熔解曲线差异图将杭白菊与黄山贡菊熔解曲线差异放大，更有利于区分与鉴定。

a：杭白菊；b：黄山贡菊；c：菊花对照品图4 杭白菊及黄山贡菊鉴定的高分辨率熔解曲线差异图

2.3 扩增产物的序列分析

分别对5份杭白菊和5份黄山贡菊样品的PCR扩增产物进行测序分析，结果如图5。测序结果序列分析结果显示：杭白菊第230位点碱基为T，而黄山贡菊230位点处为C，杭白菊与黄山贡菊ITS2序列仅在230位点出现差异。杭白菊与购自中国食品药品鉴定研究院的菊花ITS2序列一致。

图5 杭白菊及黄山贡菊ITS2序列差异位点示意图

3 讨 论

菊花入药历史悠久，在道地产区栽培时间久远。因无性繁殖及频繁引种，导致菊花的组织形态、外部形态及理化成分产生差异，演化成“杭菊”、“贡菊”、“亳菊”、“滁菊”、“济菊”、“祁菊”、“怀菊”、“川菊”等不同栽培类型[15]。对不同种源菊花的外部形态及分子标记鉴定结果显示，杭白菊与贡菊亲缘关系最近，但两者理化成分存在显著差异，菊花的理化成分主要包括黄酮类、酚酸类和挥发油类等活性物质[14-16，19-20]。葛永斌等[12]利用比色法、HPLC和GC-MS方法分析不同产地菊花的几类成分，发现杭菊与贡菊挥发油、黄酮成分总量种类差异较大，贡菊所含黄酮和挥发油含量均高于杭菊。杭白菊和黄山贡菊的Zn、Mn、Fe、Cu、Mg和Pb等微量元素进行测定分析表明，杭白菊Fe含量高于黄山贡菊，而黄山贡菊Mn，Ca含量显著高于杭白菊[21]。因此二者药效及保健效果存在一定差异，入药或饮用时需加以区分。

传统鉴别菊花的方法主要采用性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等方法。徐娟华等[16]根据头状花序的总苞片、舌状花、管状花、花托等特征对杭白菊和贡菊等5种菊花进行解剖学分析，确定杭白菊和贡菊的原植物基原为D.morifolium(Ramat.) Tzvel。同样，周建理等[15]对杭白菊、贡菊、亳菊等5个品种的菊花进行系统的形态学比较，鉴别商品菊花的性状，发现杭白菊与贡菊在总苞片数目形状上差异明显。王勤等[22]选取杭菊、贡菊以及怀菊，严格按照相关标准进行叶长度、宽度，头状花序直径的测量，并利用统计软件进行分析，结果显示，不同的菊花在叶形、叶片大小、头状花序大小上存在极显著差异。菊花受气候、土壤环境、生长发育阶段等因素的影响，形态外观及理化特征差异较大，仅仅依靠主观性强的传统鉴别中药材的方法难以精准区分。

分子标记技术用于鉴别中药具有灵敏度高、特异性强、稳定可靠等优点。徐文斌等[20]利用分子标记技术对22个类型的药用菊花进行遗传多样性的RAPD初步分析，结果表明利用RAPD技术可以将杭菊、贡菊、亳菊和怀菊区分。吕琳等[14]分析不同种源药用菊花的ISSR分子标记，聚类分析结果表明，杭白菊和贡菊亲缘关系较近，怀菊、祁菊及小亳菊则聚为一支。利用遗传多样性关系分析可以将不同菊花聚类区分，但对菊花进行精准鉴别和鉴定尚有待于进一步研究。

ITS2作为一种DNA条形码，两端较为保守，遗传稳定性高，中间差异稳定，即使在菊科这样庞大的科系中，鉴定效果也可以达到76%，高于其他条形码序列[23]。ITS2可以通过植物ITS2序列通用引物进行扩增，其长度一般在200～400 bp之间，适合测序以及扩增[24-25]。

本文选取ITS2片段作为鉴别片段，在DNA模板10 ng/μL、引物浓度0.4 μmol/L和退火温度为60 ℃条件下，杭白菊和黄山贡菊DNA分别获得稳定、一致的熔解曲线，能清晰区分杭白菊和黄山贡菊。以菊花对照样品为基线，将其他样品荧光信号值与其进行差减后求导，获得熔解曲线差异图，将样品间熔解曲线差异放大，能够更准确地区分杭白菊和黄山贡菊。本文将高分辨率熔解曲线分析技术与ITS2序列分析结合，对种质极为相近的杭白菊和黄山贡菊进行鉴别，初步建立区分和鉴别两种菊花的分子技术，该方法可用于鉴别不同品种的菊花，但对同一品种与引种至其他产地形成的栽培种的鉴定效果本文并未涉及。本文结果可为探索高分辨率熔解曲线分析技术结合DNA条形码技术在中药材鉴定方面提供理论依据和技术参考。

4 结 论

利用高分辨率熔解曲线技术检测分析杭白菊和黄山贡菊的荧光定量PCR曲线分型。标准化随Tm值变化的熔解曲线图可以区分杭白菊和黄山贡菊。以菊花对照样品为标准参照做基线，获得派生的熔解曲线差异图将二者差异放大，能够更加精准地区分杭白菊和黄山贡菊。测序结果显示：杭白菊与黄山贡菊ITS2序列存在差异，与高分辨率熔解曲线分析结果一致。

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