非酒精性脂肪性肝病患者血清维生素与抗氧化指标检测分析

余 利，冉 莉，喻 瑾，汪小兰，郎和东，周 敏，王 斌，易 龙，糜漫天

(陆军军医大学营养与食品安全研究中心/重庆市医学营养研究中心/重庆市营养与食品安全重点实验室，重庆 400038)

随着国民生活水平提高，生活方式和饮食结构改变，非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病率呈显著上升趋势，发病年龄日趋年轻化。NAFLD是以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为特征的临床病理综合征，后期可导致肝纤维化、肝硬化及肝功能衰竭等系列肝脏损害，并且与糖尿病、动脉粥样硬化性心血管疾病等发生密切相关[1]。目前，国内外NAFLD的临床诊断主要依据病理学和影像学检测，但影像学检测价格较高，病理学活检风险较大，因此，寻找敏感的血清学检测指标对于快速诊断NAFLD十分必要。NAFLD的发病机制复杂，研究表明代谢失衡、氧化应激、炎性反应等均参与NAFLD疾病病程。本研究旨在通过人群研究，检测血清中与NAFLD发生密切相关的多个维生素和抗氧化指标的水平及检测指标间的相关性，同时考察不同检测方法对部分检测指标的影响，筛选发现可能作为NAFLD诊断的敏感血清学指标，为NAFLD的诊断、预防和治疗提供新的依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2014年9-12月于本院体检中心体检的患者共806例。NAFLD纳入标准：符合中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制订的NAFLD诊断标准(2010年修订版)[2]。排除标准：过量饮酒或肝炎病毒感染；胃肠道疾病，各种严重的慢性疾病或肝肾功能不全，恶性肿瘤；近1个月内曾患有急慢性感染性疾病、创伤或手术；妊娠或哺乳期妇女。最终纳入80例NAFLD患者为NAFLD组，其中男60例，女20例，年龄28～68岁，平均(46.89±9.35)岁。选取同时期体检的，与NAFLD患者年龄、性别相匹配的健康人群为健康对照组，均无代谢综合征表现，肝脏超声和肝功能均正常。健康对照组最终入选80例，其中男62例，女18例，年龄23～68岁，平均(45.35±11.87)岁。本研究获陆军军医大学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1检测指标及方法 采集人群血样。清晨采集受试者空腹静脉血5～10 mL，静置1 h，经3 000 r/min离心10 min，分离取血清待测。NAFLD患者血清维生素检测指标包括：维生素A(vitamin A，VA，酶联免疫吸附法)、维生素D(vitamin D，VD，分别采用酶联免疫吸附法和酶供体竞争法)、维生素E(vitamin E，VE，比色法)和维生素B12(vitamin B12，VB12，酶联免疫吸附法)、血清视黄醇结合蛋白(retinol binding protein，RBP，胶乳免疫比浊法)。血清抗氧化指标包括：丙二醛(malonaldehyde，MDA，硫代巴比妥酸法)、超氧化物歧化物(superoxide dismutase，SOD，分别采用邻苯三酚底物法和WST-1法)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH，微量酶标法)。所有指标试验操作按说明书步骤进行，吸光度的测定均采用酶标仪进行检测。健康对照组检测指标为血清MDA和GSH。

1.2.2仪器与主要试剂 吸光度检测采用SpectraMax®M2多功能酶标仪(Molecular Devices)进行。RBP试剂盒购于中生北控生物科技有限公司；ELISA试剂盒购自上海通蔚生物科技有限公司；VE、MDA、SOD(WST-1法)和GSH检测试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司；VD(酶供体竞争法)和SOD(邻苯三酚低物法)试剂盒购自九强生物技术有限公司。

1.3各指标正常参考值 RBP：25～70 mg/L[3]，VA：大于1.05 μmol/L[4]，VD(酶供体竞争法)：8～60 ng/mL[5]，VE：5～20 μg/mL[6]，VB12：88.8～133.2 ng/L[7]，SOD(邻苯三酚底物法)：129～216 U/mL[8]。样本值小于正常参考值则为缺乏，所占百分率为缺乏率。

2 结 果

2.1NAFLD患者血清维生素与抗氧化指标检测结果 因人群血清样本采集量有限，同一血清样本不能完成所有指标的检测，因此各检测指标的实际样本数有所差异。检测结果发现：与正常参考值比较，NAFLD患者RBP缺乏率为11.6%；VA缺乏率(缺乏+边缘缺乏)为38.4%；VD(酶供体竞争法)缺乏率为7.9%；VE缺乏率高达86.0%；SOD缺乏率为27.9%，VB12无缺乏。NAFLD组与健康对照组血清MDA水平比较差异无统计学意义(Z=0.617，P=0.539)，但NAFLD组血清GSH水平明显低于健康对照组(t=-4.681,P=0.001)，见表1、2。

表1 NAFLD组血清维生素与抗氧化指标检测结果

表2 NAFLD患者组与健康对照组血清抗氧化指标检测结果

2.2NAFLD患者血清学指标的不同测定方法一致性分析 采用酶联免疫法和酶供体竞争法两种方法检测血清VD的水平，检测值分别为616.7(370.3,1 067.0)ng/mL和(62.66±32.05)ng/mL，两组检测值比较差异有统计学意义(Z=-9.341，P=0.001)，且一致性检验结果显示两种方法之间无相关性(ICC=0.000，P=0.501)。

采用邻苯三酚底物法和WST-1两种方法检测血清SOD水平，检测值分别为(138.61±23.53)U/mL和(58.01±12.99)U/mL，两组检测值比较差异有统计学意义(F=10.495，P=0.002)，且一致性检验结果显示两种方法之间无相关性(ICC=-0.777，P=0.987)。

3 讨 论

目前国内外公认的NAFLD诊断标准主要包括3个方面：(1)组织学或影像学检测出肝脏脂肪变性；(2)无饮酒史或饮酒量在标准之内(每周饮酒量男性小于140 g，女性小于70 g)；(3)排除导致脂肪肝的慢性肝病因素，如病毒性肝炎、自身免疫性肝脏疾病及代谢性或遗传性肝病等。然而，临床上对NAFLD患者最常见的诊断方法还是超声检测，同时结合血清生化指标(血糖、血脂和转氨酶等)，但是超声检测价格较高，而单一的血清学指标并不敏感和准确。近年对NAFLD发病机制的研究发现，营养代谢失衡、氧化应激和炎性反应等参与NAFLD发生、发展，因此，是否能够将多个血清学指标特别是营养素、抗氧化指标等作为常规检测指标纳入NAFLD的诊断标准，以提供NAFLD的诊断准确率，值得研究。本研究提示，血清维生素VA和VE及抗氧化指标SOD、GSH在NAFLD患病人群中的血清水平明显降低，提示以上指标对NAFLD的临床诊断具有重要意义。

3.1NAFLD患者血清维生素指标 目前国内有关成人VA营养状况研究很少，有限的研究多集中于城市居民，且结果差异较大。本研究中血清VA水平普遍低于同类研究[9]，提示NAFLD患者血清VA较低，在其早期筛查诊断时可考虑纳入该指标。

血清VD水平是判断人体VD状态的主要依据，全球人口VD水平平均为20.8 ng/mL[10]，VD缺乏或不足在中国普通人群很常见[11]。近年研究发现，VD的抗炎、抗氧化及抗纤维化效应可能参与了NAFLD的发病及发展[12]。但有关VD与NAFLD发生、发展的临床研究资料较少且研究结果尚存分歧，尽管存在争议，最近的一篇Meta分析仍显示，VD缺乏可能在NAFLD的发生和进展中起一定的作用[13]。因此，关注NAFLD危险人群的VD水平，对NAFLD早期预防有重要意义。

在NAFLD的发生过程中，肝细胞变性坏死，激活吞噬细胞和炎性反应，引起呼吸爆发和细胞崩解而产生大量超氧阴离子自由基、羟自由基等，机体为清除过量的自由基，消耗大量VE等抗氧化剂，导致其水平显著降低[14]。本研究中NAFLD患者血清VE水平低于杨燕[15]、张岱[16]的研究，且仅14%的NAFLD患者VE水平处于正常范围值。即不同程度的肝细胞病变状态下，血清VE水平低于健康人群。

3.2NAFLD患者血清抗氧化指标 本研究中NAFLD患者的GSH水平较健康对照组明显降低。GSH是内源性抗氧化剂，是衡量机体抗氧化能力的重要因素，研究显示，在NAFLD患者中，反映氧化应激、脂质过氧化程度的指标GSH、GSH/GSSG明显降低，GSSG、MDA明显升高，提示NAFLD患者存在脂质过氧化和氧化应激状态[17]。NAFLD患者的血清MDA可一定程度上反映脂质过氧化和氧化应激状态，SOD活性作为反映抗氧化能力指标之一[18]，NAFLD患者的MDA和SOD水平及活性状态应该纳入NAFLD危险人群体检的早期指标体系中。

3.3不同检测方法的一致性 本研究采用组内相关系数(评价一致性的理想指标，它对系统误差和随机误差均敏感[19])对两种检测方法的结果进行一致性分析。血清VD采用ELISA法和酶供体竞争法测定，组内相关系数未显示出相关性，且ELISA方法检测的VD水平远超出正常值，而酶供体竞争法检测的VD水平与王天宝等[20]2013年研究结果相比，水平基本在正常范围内；贾新转[21]研究显示，中国北方健康人群血清总25羟维生素(25OHD)水平为1.67～44.80 ng/mL，均值为(18.80±6.65)ng/mL。因此酶供体竞争法能较好地反映人体血清VD的水平。

经北京地区120例健康人群样本验证，采用邻苯三酚底物法测定SOD的正常参考值范围为110～215 U/mL，本研究结果基本在正常值范围内。而采用WST-1法测定的SOD值不在该参考范围内，一致性分析显示，两种方法无相关性。因此，邻苯三酚底物法能更好地反映血清SOD的水平，且邻苯三酚底物法试剂盒是用于自动生化分析仪检测的，能更好地避免人工加样产生的误差，更适用于大样本的人群血清SOD水平检测分析。

综上，NAFLD患者血清维生素指标VA、VE、GSH和SOD水平的改变，表明其抗氧化能力降低，可能导致肝细胞的进一步损伤。因此，由这些指标构成的指标体系可能进一步丰富NAFLD临床诊断标准，对NAFLD的临床诊断具有重要意义，同时应当选择合适的检测方法。

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