MBP-1在人食管癌细胞株Ec109细胞增殖、凋亡和侵袭中的作用

陈家骅，李元明，王 磊，叶力波，伊斯拉木江，木沙由夫，哈里木，齐 海

(新疆医科大学第二附属医院心胸外科，乌鲁木齐 830063)

研究表明,食管癌是多种因素、多基因、多步骤相互作用的结果[1]。癌症-MYC基因(cancer-MYC,C-myc)作为myc家族重要成员,具有癌基因功能,在调控肿瘤细胞增殖、转移、侵袭及凋亡等过程中发挥重要作用[2]。有研究指出,C-myc启动子结合蛋白1(C-mycpromoterbindingprotein1,MBP-1)可特异性结合到C-myc基因P2启动子上而从转录水平上抑制C-myc基因表达,从而特异性阻断肿瘤发生及进展过程[3]。本研究分别上调和特异性沉默人食管癌Ec109细胞中MBP-1基因,观察其对细胞生物学特性的影响。1 材料与方法1.1 材料 人食管癌Ec109细胞株购自通派生物公司,RPMI-1640培养基、胎牛血清、二甲基亚砜(DM-SO)、胰酶购自美国Gibco公司,Trizol总RNA提取试剂盒、脂质体LipofectionTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司,逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司,MBP-1引物、内参引物、干扰序列、模拟序列、阴性对照序列由上海生工生物公司设计合成,四甲基偶氮唑蓝(MTT)液购自北京碧云天公司,细胞周期和凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物公司,兔抗人MBP-1、C-myc、细胞周期素(Cyclin)D1多克隆抗体均购自美国Abcam公司,兔抗人CyclinE单克隆抗体购自美国SantaCruz公司,化学发光液购自长沙艾佳生物公司,实时定量PCR仪购自美国ABI公司,Transwell小室、流式细胞仪均购自美国BD公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养及分组 将Ec109细胞株置于含胎牛血清的RPMI-1640培养基中,37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。胰酶消化后传代。取对数生长期细胞,利用脂质体LipofectionTM2000转染试剂盒转染,将细胞分为4组。(1)MBP-1模拟物组:转染MBP-1模拟序列为正义链5'-TGGATGTGGAATGTGT-GCGA-3',反义链5'-TTTGTACACCCTAAGC-CTCC-3';(2)siRNA-MBP-1组:转染siRNA-MBP-1序列为正义链5'-GAAGTATGACCTGGACTTC-3',反义链5'-GGAGACTGAAGATACCTTC-3';(3)阴性对照组:转染空白质粒;(4)空白对照组:不做任何处理。各组转染后培养48h,完成后续实验。1.2.2 实时定量PCR检测各组细胞中MBP-1表达 取各组转染培养48h细胞,加入细胞裂解液,提取总RNA,用紫外分光光度计检测纯度,以A260/A280≥1.80为合格。将总RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板进行PCR。引物序列如下,MBP-1:上游5'-AAGTAAGCTGTGGGCAG-3',下游5'-AGTAT-TCTCATGGGTCAC-3';GAPDH:上游5'-AAATC-CCATCACCATCTTCC-3',下游5'-TCACACCCAT-GACGAACA-3'。反应条件:92℃1min,92℃45s,56℃30s,72℃30s,连续循环40次,每个样品均设置3个平行反应复孔。用2-△△Ct法获得各组细胞中MBP-1相对表达量[4]。1.2.3 MTT法检测不同转染组细胞增殖情况 取各组对数生长期细胞,接种于96孔板,调整浓度为1×104/孔,分别于培养24、48、72、96h时,加入MTT液,培养3h,取出培养板,去除培养液,加入二甲基亚砜(DMSO),室温下振荡摇匀10min。酶标仪检测450nm处各孔吸光度(A)值,每孔检测3次,取均值[5]。1.2.4 流式细胞仪检测各转染组细胞凋亡情况 取各组培养48h细胞,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,调整细胞密度为1×106/mL,取1mL,1000r/min离心6min,取细胞,用预冷PBS液重悬,再次离心,取细胞重悬于100μL缓冲液中,加入AnnexinV和碘化丙啶(PI)各5μL,摇匀,室温下避光放置10min,加入缓冲液400μL,1h内上机检测[6]。1.2.5 流式细胞仪检测各转染组细胞周期情况 取各组培养48h细胞,PBS洗涤3次,各样品细胞总数为2×106,于1000r/min进行离心6min,预冷PBS洗涤,加入预冷的70%乙醇1mL,摇匀,4℃过夜固定。1200r/min离心5min,取细胞沉淀,加入预冷PBS,RNaseA40μL,避光温育25min,加入PI200μL,避光染色15min,60min内上机检测[7]。1.2.6 Transwell检测细胞侵袭能力 取各组培养48h细胞,胰酶消化,取细胞1×105,置于Transwell小室上室,将含10%胎牛血清RPMI-1640培养基置于下室,于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养12h,取出小室,多聚甲醛固定,吉姆萨(Giemsa)染色,于显微镜下观察穿孔细胞数,并拍照计数,重复检测3次。1.2.7 Westernblot法检测 各组细胞中MBP-1、C-myc、CyclinD1和CyclinE蛋白表达取各组培养48h细胞,加入细胞裂解液,提取总蛋白,用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度检测试剂盒对检测总蛋白纯度,金属浴100℃变性10min。取25μg蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳,电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脱脂奶粉封闭120min,TBST冲洗3次,分别将一抗MBP-1、C-myc、CyclinD1、CyclinE抗体加入(稀释比例1∶200、1∶800、1∶500和1∶800),4℃过夜孵育,加入二抗,室温孵育1h,TBST冲洗3次,加入ECL发光液,显影,利用Quantity-One图像分析软件分析,获得各组细胞中蛋白相对表达量[8]。1.3 统计学处理 采用SPSS21.0统计分析软件对数据进行分析,计量资料用x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 各组细胞中MBP-1基因表达比较 siRNA-MBP-1组、MBP-1模拟物组、阴性对照组及空白对照

组细胞中MBP-1mRNA相对表达量分别为0.44±0.05、0.85±0.10、0.66±0.08和0.63±0.07,siRNA-MBP-1组细胞中MBP-1基因表达被抑制,而MBP-1模拟物组则表达增加(P<0.05),见图1。2.2 各组细胞增殖情况比较 与空白对照组及阴性对照组相比,MBP-1模拟物组细胞48、72、96h时A值均降低,而siRNA-MBP-1组A值均升高(P<0.05),见图2。2.3 各组细胞凋亡率比较 siRNA-MBP-1组、MBP-1模拟物组、阴性对照组、空白对照组细胞凋亡率分别为(14.7±3.3)、(39.5±6.2)、(25.6±5.1)、(24.5±4.9)%,相比于空白对照组及阴性对照组,siRNA-MBP-1组细胞凋亡率降低,MBP-1模拟物组则升高(P<0.05),见图3。 a:P<0.05,与siRNA-MBP-1组比较图1 各组细胞中MBP-1基因表达比较图2 各组细胞增殖情况 A:MBP-1模拟物组;B:siRNA-MBP-1组;C:阴性对照组;D:空白对照组图3 各组细胞凋亡情况2.4 各组细胞周期比较 与空白对照组及阴性对照组相比,MBP-1模拟物组细胞G0/G1期比例均降低,而S期和G2/M期细胞比例均增加;siRNA-MBP-1组细胞G0/G1期比例均升高,而S期和G2/M期细胞比例均降低(P<0.05),见表1。2.5 各组细胞侵袭能力比较 siRNA-MBP-1组、MBP-1模拟物组、阴性对照组和空白对照组侵袭细胞数分别为(144.3±10.1)、(64.0±8.1)、(86.5±7.6)、(88.2±8.4)个。与空白对照组及阴性对照组相比,siRNA-MBP-1组侵袭细胞数增加,而MBP-1模拟物组则减少(P<0.05),见图4。表1 不同转染组细胞周期情况比较(x±s,%)组别G0/G1期S期G2/M期MBP-1模拟物组26.8±3.5ab42.3±2.6ab30.9±3.3absiRNA-MBP-1组64.2±2.1ab21.3±1.8ab14.5±1.9ab阴性对照组43.8±2.534.5±3.121.7±2.7空白对照组45.3±2.936.7±3.318.0±2.3F19.67225.38117.262P<0.01<0.01<0.01 a:P<0.05,与阴性对照组比较;b:P<0.05,与空白对照组比较 A:MBP-1模拟物组;B:siRNA-MBP-1组;C:阴性对照组;D:空白对照组图4 各组细胞侵袭能力(Giemsa染色,×200)2.6 各组细胞中MBP-1、CyclinD1和CyclinE蛋白表达比较 与空白对照组及阴性对照组相比,MBP-1模拟物组细胞中MBP-1蛋白相对表达量升高,而siRNA-MBP-1组降低;MBP-1模拟物组细胞中C-myc、CyclinD1和CyclinE蛋白相对表达量降低,而siRNA-MBP-1组均升高,比较差异均有统计学意义(P<0.05),见表2、图5。

表2 各组细胞中MBP-1、CYclin D1和CYcline E蛋白表达比较

3 讨 论

细胞周期紊乱、细胞侵袭能力增强是导致食管癌转移的重要因素[9]。研究表明，癌基因C-myc过表达可加速细胞增殖，且可引起细胞DNA损伤及中心体数量异常而导致染色体破坏[10]。C-myc在多种恶性肿瘤细胞中呈过表达[11]，在肿瘤恶性增殖、侵袭、转移中发挥重要作用[12]。MBP-1作为特异性C-myc抑制基因，可在转录水平上抑制其表达，从而在肿瘤发生、进展过程中发挥类似于抑癌基因的功能[13]。

本研究结果显示，MBP-1模拟物组细胞中MBP-1基因和蛋白表达量均上调，而siRNA-MBP-1组细胞中MBP-1基因和蛋白表达量均抑制，说明采用转染模拟物和抑制物的方式可成功地将人食管癌Ec109细胞中MBP-1基因上调或抑制。MTT结果显示，上调MBP-1基因可抑制细胞增殖，而抑制MBP-1基因则可促进细胞增殖，提示MBP-1基因与细胞增殖密切相关，是调控细胞增殖过程的重要基因。本研究结果显示，MBP-1模拟物组细胞凋亡率显著增加，且G0/G1期细胞比例降低，S期和G2/M期细胞比例升高，而siRNA-MBP-1组细胞凋亡率则降低，且G0/G1期细胞比例升高，S期和G2/M期细胞比例降低，说明MBP-1基因可通过影响细胞周期，而参与细胞凋亡的发生。同时，Western blot结果显示，MBP-1模拟物组细胞中C-myc蛋白表达被抑制，而siRNA-MBP-1组则表达上调，说明MBP-1作为C-myc基因的抑制基因，可能通过抑制C-myc表达而达到减少细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。本研究结果说明MBP-1基因与Ec109细胞侵袭能力密切相关。

研究显示，Cyclin D1和Cyclin E作为重要的细胞周期蛋白激酶复合物，在调控细胞周期进程中发挥重要作用[14]。本研究显示，MBP-1模拟物组细胞中C-myc、Cyclin D1和Cyclin E蛋白相对表达量均降低，而siRNA-MBP-1组均升高，说明MBP-1基因可通过促进或抑制细胞中Cyclin D1和Cyclin E蛋白表达，从而在调控细胞周期及细胞增殖、凋亡中发挥作用。

综上所述，MBP-1与人食管癌细胞株Ec109细胞增殖、凋亡、侵袭能力密切相关，其机制可能与细胞周期异常有关。

[1]ALSOP B R,SHARMA P.Esophageal Cancer[J].Gastroenterol Clin North Am,2016,45(3):399-412.

[2]TANAKA S,NAGATA N,MINE S,et al.Endoscopic appearance of AIDS-related gastrointestinal lymphoma with C-myc rearrangements:case report and literature review[J].World J Gastroenterol,2013,19(29):4827-4831.

[3]TROJANOWICZ B,WINKLER A,HAMMJE K,et al.Retinoic acid-mediated down-regulation of ENO1/MBP-1 gene products caused decreased invasiveness of the follicular thyroid carcinoma cell lines[J].J Mol Endocrinol,2009,42(3):249-260.

[4]宋佳伦,杨琦.转录因子扭曲基因表达异常在早期子宫颈癌发病中的意义及对预后的影响[J].中国妇幼健康研究,2016,27(9):1066-1068.

[5]林博川.兔骨折合并脑外伤模型血清对鼠骨折愈合影响的实验研究[D].广州：广州医学院,2011.

[6]许静.miR-21对人宫颈鳞癌的体内外分子调控机制初探[D].广州：暨南大学,2011.

[7]范才文,向秋,田晶,等.Stathmin沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞的恶性表型[J].天津医药,2013,41(5):462-464.

[8]袁金,康佳丽,廖花,等.靶向融合肽TAT-OSBP-MKK6(E)对卵巢癌裸鼠移植瘤的抑制作用[J].肿瘤,2015,35(2):161-167.

[9]XU X,XIONG X,SUN Y.The role of ribosomal proteins in the regulation of cell proliferation,tumorigenesis,and genomic integrity[J].Sci China Life Sci,2016,59(7):656-672.

[10]SUN X X,SEARS R C,DAI M S.Deubiquitinating C-myc:USP36 steps up in the nucleolus[J].Cell Cycle,2015,14(24):3786-3793.

[11]CHAE H,RYU H,CHA K,et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a biomarker of renal impairment in patients with multiple myeloma[J].Clin Lymphoma Myeloma Leuk,2015,15(1):35-40.

[12]时汀,张建淮.IWR-1对人肝癌细胞株Hep3B的增殖及Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用[J].肿瘤防治研究,2016,43(3):207-210.

[13]ZEMPLENI J,LIU D,CAMARA D T,et al.Novel roles of holocarboxylase synthetase in gene regulation and intermediary metabolism[J].Nutr Rev,2014,72(6):369-376.

[14]WU M,WU Y,LAN T,et al.Type Ⅱ cGMPdependent protein kinase inhibits EGF-induced JAK/STAT signaling in gastric cancer cells[J].Mol Med Rep,2016,14(2):1849-1856.