正清风痛宁对大鼠骨质疏松性椎体骨折的影响＊

2018-05-10陈德森胡熙耀吴胜英

世界科学技术-中医药现代化 2018年2期

罗霞，陈德森，李莉，胡熙耀，万超，吴胜英＊＊

（1.十堰市太和医院针灸科（湖北医药学院附属医院十堰 442000；2.湖北医药学院基础医学院机能实验室十堰 442000）

正清风痛宁注射液的主要成分是盐酸青藤碱，是从中草药青风藤中提取的一种单体生物碱，具有消肿、抗炎、止痛等功效[1,2]。前列腺素E2（PGE2）是重要的致痛物质，可引起的痛觉过敏，6-酮-前列腺素E1α（6-keto-PGE1α）是PGE2的前体，动物实验发现青藤碱可抑制6-keto-PGE1α合成，且N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂可抑制这种痛觉过敏现象，而N-甲基-D-天冬氨酸受体兴奋与一氧化氮（NO）的活化密切相关[3]。NO由神经元型一氧化氮合酶（nNOS）催化L-精氨酸后生成，是一种重要的炎症介质和扩血管物质，可介导感觉信号的传递，增加对致痛物质的PGE2敏感性，其合成增多会提高神经突触的兴奋性，增强对机体对痛觉反应的敏感性[4]。八肽胆囊收缩素（CCK-8）具有拮抗阿片肽的镇痛作用，为目前已知的抗阿片肽作用最强的物质，脑脊液中CCK-8含量与痛觉相关[5,6]。青藤碱及其制剂正清风痛宁注射液的镇痛作用研究较多，但其对骨质疏松性椎体骨折引起的疼痛和骨量降低影响骨折愈合的研究却鲜有报导。本研究试图从大鼠骨质疏松性椎体骨折模型中致痛相关因子及青藤碱制剂正清风痛宁注射液对其影响来研究其作用机制。

1 实验材料

1.1 药物与试剂

正清风痛宁注射液（湖南正清制药集团股份有限公司，国药准字：02372409Z）；CCK-8、6-keto-PGE1α、NO及nNOS检测ELISA试剂盒均购自上海蓝基生物科技有限公司。

1.2 实验动物

SPF级健康雌性SD大鼠40只，鼠龄3个月，体质量（180-190）g，由湖北省实验动物研究中心提供。动物生产合格证号：SCX K（鄂）2017-0005。

2 实验方法

2.1 大鼠骨质疏松性椎体骨折模型

取SD大鼠30只，参考文献[7]大鼠麻醉前均禁水禁食6 h，用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后将其腹部朝上固定在手术台上。下腹部正中备皮，碘伏消毒，用手术刀切开下腹部正中皮肤、分离浅筋膜、深筋膜直达肌层，分离输卵管并沿输卵管寻找卵巢，然后用丝线结扎输卵管峡部，剪去双侧卵巢。然后分层缝合，最后再次碘伏消毒缝合皮肤。参考文献[8]，标准饲料饲养2个月后再同次方法麻醉大鼠，腹部向下固定，相当于椎体L3水平备皮，皮肤消毒。纵行切开大鼠L3椎体皮肤、暴露腹膜后间隙、分离背阔肌、背最长肌、棘间肌和韧带，暴露L3椎间盘，从椎体侧前方剪断L3椎体前缘，然后分层缝合。术后不做内固定，剪断的椎体断端骨小梁会因相互挤压、嵌插、扭曲而导致L3椎体变短，在内就会因为自身重力和运动等因素的作用下压缩变短成模[9]。

2.2 实验动物分组与处理

将上述手术造模的30只SD大鼠，采用随机数字表编号随机分随机分模型组、正清风痛宁0.5 mg组和2 mg组，每组10只。剩下的10只未手术的正常鼠设为假手术组，本组仅做皮肤消毒和备皮处理，不手术，作为对照。在建模术后4周起，在L3脊柱两侧夹脊穴注射正清风痛宁，0.5 mg组（0.5 mg）和2 mg组（2 mg）分别于L3夹脊穴注射正清风痛宁注射液进行治疗，假手术组和模型组给予等体积生理盐。以上各组每天注射治疗1次，共4周。实验动物12 h交替光照并分笼饲养，自由摄食、饮水及活动，动物房温度为25±2℃，湿度75%。

2.3 主要检测指标

于成模后及治疗2周时分别取脑脊液，采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测八肽胆囊收缩素（CCK-8）、6-酮-前列腺素E1α（6-keto-PGE1α）、一氧化氮（NO）及神经元型一氧化氮合酶（nNOS）含量，采用骨定量超声诊断技术检测骨折腰椎骨定量振幅衰减（BUA）及骨密度（BMD）。

表1 两组BUA及BMD比较（n=10，）

注：BUA：骨定量振幅衰减；BMD：骨密度；与假手术组比较，△P＜0.05；与同组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

2.4 疼痛行为学观察

采用机械触诱发痛和自发痛测定l、2、3、4周机械缩足阈值（MWT）和自发痛抬腿次数及抬腿持续时间。MWT测定[10]：将大鼠置于机械触诱发痛网格上，适应30 min后用不同折力的von Frey纤毛依次刺激左后足底（6-8秒），以大鼠产生明显的缩爪或舔足为阳性标准，每根针丝测量5次，每只大鼠均从0.4 g的针丝开始刺激，以出现缩足反射3次以上的最小von Frey纤维强度为机械刺激缩足阈值（MWT）。大鼠自发痛测定：将大鼠置于特制的有机玻璃观测室，动物适应30 min后开始实验，观察30 min内大鼠后肢自发抬腿次数及抬腿持续时间，并计算治疗4周后足缩足阈值均值。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 正清风痛宁对大鼠BUA及BMD的影响

假手术组成模后和治疗后BUA及BMD无明显变化（P＞0.05）。模型组、正清风痛宁0.5 mg组和2 mg组成模后与假手术组比，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组治疗后BUA及BMD均明显降低，与假手术组比，差异有统计学意义（P＜0.05）；2 mg组治疗后BUA及BMD均明显升高，与同组成模后和模型组比，差异有统计学意义（P＜0.05），（表1）。

3.2 正清风痛宁对大鼠NO、nNOS、CCK-8和6-keto-PGE1α的影响

假手术组成模后和治疗后NO、nNOS、CCK-8和6-keto-PGE1α含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组、正清风痛宁0.5 mg组和2 mg组成模后与假手术组比，差异有统计学意义（P＜0.05）；2 mg组治疗后与同组成模后和模型组比，差异有统计学意义（P＜0.05）。（见表2）。

表2 两组NO、nNOS、CCK-8和6-keto-PGE1α比较（n=10，）

注：八肽胆囊收缩素（CCK-8）、6-酮-前列腺素E1α（6-keto-PGE1α）、一氧化氮（NO）及神经元型一氧化氮合酶（nNOS）；与假手术组比较，△P＜0.05；与同组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

3.3 正清风痛宁对大鼠自发痛的影响

假手术组成模后和治疗后抬腿次数、抬腿持续时间及治疗4周后足缩足阈值均值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组治疗后抬腿次数和抬腿持续时间均增多和延长，治疗4周后足缩足阈值均值降低，与假手术组比，差异有统计学意义（P＞0.05）。正清风痛宁0.5 mg组和2 mg组成模后与假手术组比，差异有统计学意义（P＞0.05）；2 mg组治疗后与同组成模后和模型组比，差异有统计学意义（P＞0.05）。（表3）。

表3 大鼠自发痛行为及4周后足缩足阈值均值比较（n=10，）

注：与假手术组比较，△P＜0.05；与同组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

3.4 正清风痛宁对大鼠MWT的影响

假手术组MWT在治疗期间无明显变化，前后比较差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组和正清风痛宁0.5 mg组MWT随治疗时间延长逐步降低，与假手术组比，差异有统计学意义（P＞0.05）；2 mg组MWT随治疗时间延长逐步提高，治疗后与同组成模后和模型组比，差异有统计学意义（P＞0.05）。（表4）。

表4 大鼠MWT在治疗期间变化情况比较（n=10，）

注：与假手术组比较，△P＜0.05；与同组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

4 讨论

骨质疏发病率逐年攀升，属骨科类常见代谢性骨病变，中老年人器官处于衰退期，在骨代谢过程当中，骨的形成和骨吸收之间的偶联发生缺陷，钙磷等物质代谢失衡，骨组织质量降低，骨密度减小，骨质脆性增加而形成老年性骨质疏症[11]。同时，由于患者骨质不断吸收骨组织，因此骨强度降低，在外力的作用下极容易发生骨折，临床出现驼背、身长缩短、疼痛等临床症状，严重影响老年人的正常生活[12,13]。骨质疏松性椎体骨折者一般经中医中药保守治疗可达到满意临床疗效，但严重者可能造成消化及呼吸等多系统功能障碍，甚至导致死亡。因此，骨质疏松性椎体骨折应及时治疗以改善临床症状，提高患者生存质量[14-16]。研究发现，青藤碱及其制剂正清风痛宁具有镇痛、抗炎、抗风湿等药理作用，在治疗骨质疏松、骨性关节炎、等引起的疼痛性疾病有肯定疗效[17,18]。

有研究表明，骨折后受压组织因血液循环不足，PGE2、CCK-8等会大量集聚加重骨折部位周围肌肉发生炎症反应，而6-keto-PGE1α为PGE2的终代谢产物，具有强烈的血管收缩作用及致痛作用，可直接刺激神经根引起疼痛，或增加神经根对缓激肽等致痛物质的敏感性，使神经根痛阈下降引起疼痛加剧[19]。动物实验发现，由PGE2诱导的痛觉过敏可被N-甲基-D-天冬氨酸受体的拮抗剂所抑制，N-甲基-D-天冬氨酸受体兴奋与NO的活化密切相关，NO的活化抑制后，PGE2所致伤害反应也会随之剂量依赖性降低，由此提示PGE2诱导的痛觉过敏是由NO介导的感觉信号传递的相互作用介导的，而青藤碱能显著降低内皮细胞分泌NO的作用[20,21]。

在本实验中，选用中药制剂正清风痛宁夹脊穴注射，该治疗方法遵循中医经穴治疗体系这一理论依据，以经络为载体，使“针、药、穴”综合作用于骨折部位及神经，可明显提高药物吸收和药物治疗作用[22]。观察发现，骨定量超声显示BUA及BMD均明显高于模型组。在本研究中所用中医制剂正清风痛宁注射液是从中药青风藤中提取青藤碱，青风藤药性温、味苦、辛，祛风湿，通经络[23]。这种活经通络的作用可增加骨折部位的血流量，加速局部新陈代谢，可能在一定程度上增加了骨钙沉积。正清风痛宁注射是否是通过调节钙磷代谢、减少骨量丢失、增加骨钙沉积而提高骨密度，进而促进大鼠骨质疏松性椎体骨折愈合还有待进行钙磷代谢等方面的研究。本研究还观察到2 mg组nNOS、NO、CCK-8和6-keto-PGE1α明显低于模型组。NO是一种重要的炎症介质，nNOS催化L-精氨酸后生成NO，可介导感觉信号的传递并增加对致痛物质的敏感性。机体在伤害性刺激后，nNOS即出现升高，此时Ca2+进人背根神经节和脊髓背角神纤维胞内，Ca2+依赖性的nNOS被激活，nNOS催化L-精氨酸催化生成NO并弥散至突触神经元，进一步激活鸟苷酸环化酶，使神经突触兴奋性增强，对刺激造成的痛觉反应敏感性增强[4]。2 mg组治疗后nNOS明显低于模型组，这可能是穴位注射正清风痛宁注射液，抑制nNOS催化L-精氨酸，降低NO内皮细胞分泌而产生镇痛作用有关。另一方面，有动物实验证实，CCK-8具有抗阿片肽作用，拮抗阿片肽的镇痛作用[24]。2 mg组治疗后CCK-8均明显低于模型组，提示正清风痛宁注射液可能通过抑制CCK-8分泌来降低其拮抗阿片肽，从而产生中枢镇痛效应。实验观察到2 mg组抬腿次数和抬腿持续时间降低，大鼠4周后足缩足阈值均值明显提高，1、2、3、4周MWT逐步提高，这也直接证实上述理论。

综上所述，骨质疏松性椎体骨折会造成严重的疼痛，正清风痛宁注射中的青藤碱在穴位注射吸收后，对骨质疏松性椎体骨折疼痛产生肯定的治疗作用。正清风痛宁穴位注射可能是通过增加大鼠下丘脑nNOS分泌、抑制NO和6-keto-PGE1α合成、降低CCK-8而产生中枢镇痛作用，这一作用可能成为治疗老年骨质疏松性椎体骨折疼痛及促进骨折愈合的新靶点。

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