高效液相色谱法同时测定苹果醋及原料中的17种有机酸

2018-05-10李春扬张晓磊王晨慧尹建军宋全厚

中国酿造 2018年4期

饶静,李春扬,张晓磊*,王晨慧,尹建军,宋全厚

(1.中国食品发酵工业研究院,北京 100015；2.国家食品质量监督检验中心,北京 100015)

以苹果汁或苹果浓缩汁为原料,发酵成苹果酒,然后接入醋酸菌最终发酵成苹果醋［1］。苹果醋优于传统食醋,兼有水果和食醋的营养保健功能,集营养、保健、食疗等功能为一体,其在调节新陈代谢、促进血液循环、软化血管、降低血脂、控制胆固醇水平、抗氧化性等医疗保健方面都有较好表现,消费人群也正在逐渐扩大［2-3］。有机酸作为苹果醋的主要活性成分之一,在国家标准GB/T 30884—2014《苹果醋饮料》中对其种类、含量也有明确的规定,因此准确测定有机酸的种类和含量,对于优化苹果醋发酵工艺、提高苹果醋的品质具有十分重要的意义。

已报道对有机酸测定的方法很多,包括电位滴定法［4］、分光光度法［5］、离子色谱法［6-7］、气相色谱法［8-9］、高效液相色谱法［10-12］等。上述方法中,液相色谱法最为灵敏、准确而得到广泛运用。本研究通过优化反相C18柱的色谱条件和前处理条件,建立可同时分离测定17种有机酸的高效液相色谱方法,并对苹果醋及其生产原料浓缩苹果汁、苹果酒中的有机酸含量进行分析,利用统计分析手段探寻苹果醋原辅料中有机酸分布的规律性,以期为企业调整工艺和质量控制提供一定的数据基础和分析手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：草酸、酒石酸、奎宁酸、甲酸、丙酮酸、苹果酸、丙二酸、莽草酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、反乌头酸、丙酸(纯度≥98%)：美国Sigma公司；苹果醋、浓缩苹果汁和苹果酒样品：由企业提供；甲醇(色谱纯)：美国Baker公司；磷酸氢二铵(分析纯)：天津市福晨化学试剂厂；磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、偏磷酸和磷酸(均为分析纯)：北京化学试剂公司；实验用水为Milli-Q超纯水；BNWBOND SAX SPE柱(500 mg/6 mL)和BNWBOND LC-C18SPE(500 mg/6 mL)柱、0.22μm尼龙有机滤膜：上海安谱实验科技股份有限公司；Cleanert NH2-SPE柱(500 mg/6 mL)：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Waters液相色谱仪-2487UVD紫外检测器：美国Waters公司；Milli-QReference超纯水发生器：美国Millipore公司；AL204-IC万分之一天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

分别配制10 mg/mL的草酸、酒石酸、奎宁酸、甲酸、丙酮酸、苹果酸、丙二酸、莽草酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、反乌头酸、丙酸标准储备液,于4℃冰箱中保存,使用时根据需要用流动相逐级稀释成适当浓度的标准混合工作溶液。

1.3.2 样品前处理方法

苹果醋：取一定量样品,流动相稀释10倍后过膜备用。

浓缩苹果汁和苹果酒：将C18小柱依次用甲醇、去离子水活化平衡,取样品2 mL以1 mL/min流速流经C18固相萃取预柱除去色素等干扰物,收集流出液,流动相定容至10mL,过膜备用。

1.3.3 色谱条件

InertsilRODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相为0.01 mol/L(NH4)2HPO4,pH 2.45,流速：0.5 mL/min；紫外检测波长210 nm,柱温30℃,进样量10μL。

1.3.4 测定条件优化

考察不同的流动相(磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、偏磷酸和磷酸氢二钾)、不同pH(pH 2.30、pH2.45、pH 2.70、pH 3.00和pH 3.50)的流动相、不同固相萃取柱对测定结果的影响。

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

在液相色谱的分离过程中,有机酸分子依靠在两相中分配系数不同实现分离。但因有机酸极性较大,流动相中水的比例很高,常发生酸的解离。为使有机酸尽可能以分子形式存在,一般使用酸性流动相来抑制有机酸的解离。黄桂颖等［13］比较了不同浓度的磷酸二氢铵、硫酸、磷酸和偏磷酸对有机酸分离效果的影响,发现以偏磷酸作为流动相添加剂时分离效果最佳；高海燕等［14］在以磷酸氢二钾为缓冲盐,实现了11种有机酸(纯草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、莽草酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸)的良好分离；王琳等［15］在流动相中添加磷酸氢二钠,对黄酒中的7种有机酸(草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸)进行了分离测定,也取得了较好的结果。

本实验在上述文献方法的基础上,实际比较了不同浓度的磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、偏磷酸和磷酸氢二钾对17种有机酸分离效果的影响,最终确定0.01mol/L磷酸氢二铵作为本方法的流动相条件。

2.2 pH值的选择

由于所选取的17种有机酸其pKa值跨度范围较大,各组分的保留时间对流动相的pH值非常敏感,这给色谱分离造成了一定的困难。通过优化流动相的pH值条件,以期使17种有机酸在流动相中均以一种形式存在,达到最佳的分离定量效果。考虑到一般色谱柱要求,使用的流动相pH值范围2≤pH≤9,在分离测定一元弱酸时,流动相缓冲液的pH值范围应为2≤pH≤pKa-2；如果弱酸的pKa≤4,常需要利用酸的共轭碱测定其含量,则流动相缓冲液pH值范围应为pKa+2≤pH≤9。而针对多元弱酸来说,只要提高流动相缓冲溶液的缓冲容量,按关系式2≤pH≤pKa1-1选择流动相pH值,比较能得到满意的结果［16］。本实验依据各种有机酸的解离常数pKa,以不同pH值(pH 2.30、pH 2.45、pH 2.70、pH 3.00和pH 3.50)的0.01 mol/L(NH4)2HPO4溶液作为流动相,比较其对有机酸分离效果的影响,结果见图1。

由图1可知,流动相pH值对有机酸的分离影响很大。当pH值为2.30时,乙酸和柠檬水完全不能分开；当pH值为2.70时,甲酸和奎宁酸无法分离,抗坏血酸和乳酸分离度也不理想；当pH值为2.70时,柠檬酸和富马酸、酒石酸和奎宁酸不能有效分离；当pH值为3.00时,苹果酸、莽草酸和抗坏血酸未能分离开；当pH值为3.50时,不但苹果酸、莽草酸和抗坏血酸没有得到改善,甲酸和奎宁酸也无法分离,最终选择pH2.45作为最适实验条件。

2.3 SPE柱条件的优化

由于苹果汁和苹果酒中存在较多的干扰组分,必需经过SPE处理以达到净化富集的目的。参考文献方法［17］,比较了BNWBOND LC-C18SPE、Cleanert NH2-SPE和BNWBOND SAX SPE三款固相萃取柱对样品的净化效果,结果见图2。结果表明,同一样品经三种萃取柱后分别进样HPLC分析,Cleanert NH2-SPE和BNWBOND SAX SPE柱对有机酸的保留性不强,部分目标物随淋洗液流出而损失,回收率低,而BNWBOND LC-C18SPE柱能较好地保留目标物质,因此选择BNWBOND LC-C18SPE柱。

图2 不同固相萃取柱对回收率的影响Fig.2 Effects of different solid phase extraction column on recovery rate

2.4 线性范围、检出限和定量限

将17种有机酸的标准储备液用流动相稀释成一定浓度的混合标准溶液,并在优化的实验条件下进行分析测定,以目标化合物的峰面积(y)为纵坐标,有机酸质量浓度(x,mg/L)为横坐标绘制标准工作曲线。以S/N=3和S/N=10分别确定各有机酸在样品中的检出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ),结果见表1。

表1 17种有机酸的线性关系、检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)Table 1 Linear relationships,limits of detection(S/N=3)and limits of quantification(S/N=10)of the 17 organic acids

由表1可知,除去莽草酸(R2为0.998 7)和乳酸(R2为0.998 3)之外,其他化合物的相关系数(R2)均＞0.999,说明各有机酸组分在一定浓度范围内具有较好的线性关系；方法的LOD为0.01～0.50 mg/L,LOQ为0.03～1.67 mg/L,表明所建立的方法灵敏度较高,可对有机酸含量较低的样品进行检测。

2.5 回收率及精密度

采用3水平加标方式,对苹果醋、浓缩苹果汁和苹果酒三种不同样品进行加标回收率试验,每一加标水平平行测定6次,计算平均回收率结果见表2。由表2可知,17种有机酸的平均加标回收率为74.3%～107.3%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为2.0%～7.0%。表明该方法各有机酸的回收率较为稳定,精密度良好,可以满足三种不同基质样品中17种有机酸的同时测定。

表2 17种有机酸的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Adding standard recovery rate and RSD of the 17 organic acids

续表

2.6 实际样品分析

按照上述方法,对由企业提供的苹果醋、浓缩苹果汁和苹果酒三类各5个样品进行了有机酸含量的检测,每个样品重复3次。17种混合标准品以及三类不同样品中有机酸分析的液相色谱图见图3。

由图3可知,三类样品中检出的有机酸包括酒石酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等,但不同样品之间在有机酸组成及含量上存在明显差别。浓缩苹果汁样品中的有机酸主要以苹果酸和乳酸的形式存在,其中苹果酸含量最为丰富(18 g/L左右)；苹果酒中依然以苹果酸和乳酸为主,但含量水平比苹果汁明显降低。苹果醋样品中以乙酸为最主要的有机酸成分(含量高达60 g/L),其次还含有一定量的苹果酸(1 g/L左右)和琥珀酸(0.5 g/L左右),乳酸未检出。

利用主成分分析,考察三类样品中有机酸含量分布的规律性特点。7种有机酸组分经过分析提取了2个主成分,并得到各主成分在不同变量下的载荷矩阵表(表4),载荷系数绝对值的大小即表明其对相应主成分的贡献率大小。

图4为各样品在两个主成分因子上的得分分布图,图中代表不同种类样品的各点聚集在各自特定的区域内,说明苹果醋和浓缩苹果汁、苹果酒在有机酸含量上具有显著差异。其中,浓缩苹果汁各点集中分布在X轴的正半轴,与另外两种样品有明显区别,因为其在主成分因子1代表的苹果酸(载荷系数0.976)、乳酸(载荷系数0.651)、柠檬酸(载荷系数0.969)组分上有非常高的含量；同为X轴负半轴上的苹果醋和苹果酒在Y轴的分布上差异明显,考察具体数据,因为两种产品在主成分因子2中载荷系数最大的乙酸(载荷系数-0.948)含量上存在较大差别。