原花青素对猪精液常温保存效果的影响

胡亚美，刘 斌，孙敬春，梁国栋，褚瑰燕，杨公社*

（1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100；2.大荔县众康家畜良种繁育有限公司，陕西大荔 715103）

目前，国外主要集中于对猪精液冷冻保存的理论研究[1-2]，而国内对生产实践中的常温保存为主要研究趋势。由于猪精子质膜上多不饱和脂肪酸含量丰富，当遇到活性氧族（ROS）攻击时，易发生脂质过氧化反应，造成精子氧化应激，使其失去受精能力[3]。正常情况下，精浆中含有抗氧化物质，足以维持ROS产生和清除之间的平衡，但在精液稀释保存的过程中，精浆中抗氧化物质浓度降低，平衡被打破，ROS无法及时有效地被清除，使精子产生氧化损伤。因此，在精液稀释保存过程中需要添加适量的抗氧化剂，增强精子的抗氧化能力，尽可能降低ROS对精子造成的伤害是很有必要的。

近年来，天然抗氧化剂作为一类无毒、安全的抗氧化剂逐渐引发关注，其具有重要的生物活性。谢东祺等[4]研究发现，茶多酚、维生素C都能有效提高猪精液保存效果。原花青素（OPC）是一种生物类黄酮，是目前发现的具有较强生物活性的天然抗氧化剂，其抗氧化能力虽亚于虾青素，但优于维生素C和维生素E，且其提取相对容易，生物利用安全性较高[5]。本实验在经典猪精液稀释液BTS中添加不同浓度的OPC，并在保存过程中检测猪精子抗氧化相关指标，分析OPC对猪精液常温保存效果的影响，筛选出适宜的OPC添加浓度，为促进猪精液稀释粉的产业化发展提供理论参考，为开发具有我国自主知识产权的稀释粉奠定基础。

1 材料与方法

1.1 精液来源 本实验所用精液采自杨凌西北农林科技大学畜牧教学实验基地3头健康的12月龄关中黑猪，使用手握法采精，收集射精中段富集精子部分，滤纸过滤后置于保温瓶中，30 min内带回实验室，所采原精活力镜检达0.8以上，气味和色泽正常者方可进行后续实验。

1.2 试剂 原花青素，纯度≥95%，为上海源叶生物科技有限公司产品；葡萄糖、二水合柠檬酸三钠、氯化钾、乙二胺四乙酸（EDTA）、碳酸氢钠为广东光华科技股份有限公司产品；总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（100 T/50样）、丙二醛（MDA）试剂盒（100 T/50样）为南京建成科技有限公司产品。

1.3 仪 器设备 17℃恒温箱（1005c，康佳电器有限公司）；猪精液计算机辅助分析系统（CASA）（HVIE-SSW V8.0，福州鸿视野软件技术有限公司）；精子密度分析仪（Modelo V11，葡萄牙艾普森（北京）有限公司）多功能酶标仪（Synergy H1，美国伯腾仪器有限公司）等。

1.4 BTS稀释液的配制 配方：葡萄糖37.15 g/L，柠檬酸钠6.00 g/L，EDTA 1.25 g/L，碳酸氢钠1.25 g/L，氯化钾0.75 g/L，用电子天平准确称量后配制成BTS基础稀释液。

1.5 精 液稀释与保存 将采集的公猪精液与稀释液在水浴锅内平衡10 min（温度差不超过1℃），再将稀释液沿瓶壁或者玻璃棒缓慢倒入精液中，精液与稀释液按1:4的比例稀释，稀释期间需轻轻晃动或用玻璃棒沿一个方向搅拌，使其混合均匀。稀释后的精子密度为1.85亿/mL，然后将稀释好的精液分装到已灭菌的10 mL离心管中，用毛巾包裹后放置在17℃恒温箱中避光保存，保存过程中除每次检测外不翻动离心管。

1.6 实验设计 实验分8组，以配制的BTS基础稀释液为对照组，设置7个实验组，即基础液中分别添加10、20、30、40、50、60、70 µg/mL OPC。17℃ 保存，每隔24 h检测1次精子活率、顶体和质膜完整率，每隔48 h检测1次T-AOC和MDA含量，实验重复3次。

1.7 精子常规指标检测 精子活率利用计算机辅助精液分析系统（CASA）检测；质膜完整性利用精子尾部低渗肿胀实验，各组精子每隔24 h测定1次；检测精子顶体完整率使用异硫氰酸荧光素-花生凝集素（FITCPNA）荧光染料对精子进行染色镜检，每隔24 h检测实验各组顶体完整率。实验全程避光操作。

1.8 精子生化指标检测 T-AOC活性和MDA含量严格按照说明书步骤进行测定和计算。

1.9 统计分析 利用SPSS 23.0软件对实验所得数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），处理结果均以平均值±标准差表示。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 BTS基础稀释液中添加OPC对猪精子活率的影响由表1可知，将OPC添加到BTS基础稀释液中，第0天和第1天的精子活率与对照组无显著差异（P＞0.05）；第2天对照组的精子活率与10 µg/mL OPC组差异不显著（P＞0.05），而显著低于其余实验组（P＜0.05）；第3～5天对照组精子活率均显著低于7个实验组（P＜0.05）；第 5天添加 30、40、50、60 µg/mL OPC组精子活率显著高于其他实验组（P＜0.05）。

2.2 BTS基础稀释液中添加OPC对猪精子质膜完整性的影响 由表2可知，第0天，实验组与对照组的精子质膜完整率无显著差异（P＞0.05），随着保存时间的延长，各组间的精子质膜完整性开始出现差异。第3天，40 µg/mL OPC组的精子质膜完整率最高且显著高于对照组和 10 µg/mL OPC 组（P＜0.05）。第 4～5 天，50 µg/mL OPC组精子质膜完整率最高且显著高于对照组（P＜0.05）。当OPC添加量从10 µg/mL增加至50 µg/mL时，精子质膜完整率呈上升趋势，大于50 µg/mL后开始下降，当添加量增至70 µg/mL时，与对照组基本无显著差异（P＞0.05）。由此可见，添加一定量OPC可保护精子质膜，但当浓度过高时，保护作用减弱。

2.3 BTS基础稀释液中添加OPC对猪精子顶体完整性的影响 由表3可知，第0天，20 µg/mL OPC组顶体完整率最高，且显著高于对照组和10 µg/mL OPC组（P＜0.05）。第1天，添加50 µg/mL OPC组顶体完整率最高。从第3天开始，对照组和10 µg/mL OPC组的精子顶体完整性与其余组差异显著（P＜0.05）。第5天，对照组顶体完整率已趋近70%，且显著低于7个实验组（P＜0.05）。整体而言，OPC添加量为50 µg/mL时顶体完整率最高，相对于40 µg/mL OPC组可更稳定地保护精子顶体完整性。

表1 BTS基础稀释液中添加OPC对精子活率的影响 %

2.4 BTS基础稀释液中添加OPC对猪精子T-AOC和MDA浓度的影响 由表4可知，随着BTS基础稀释液中OPC添加浓度增大，精子T-AOC活性越强。但第5天，对照组和10、20 µg/mL OPC组的T-AOC活性显著低于其他实验组（P＜0.05），且添加量为70 µg/mL时活性最高，为1.44 U/mL。稀释精液中MDA含量随OPC添加量的增加而减少，第5天，70 µg/mL OPC组的MDA含量最低，且显著低于对照组和10、20、30、40 µg/mL OPC 组（P＜0.05）。

3 讨 论

3.1 OPC对猪精子活率、质膜和顶体完整性的影响 猪精液稀释和保存过程中无法完全隔绝空气，在17℃保存条件下，精子活动频率减慢，但仍会耗能和代谢。此过程中，精子尾部中段大量的线粒体负责供能的同时，会产生ROS，少量ROS是精子生存所必需的，但积累过量会引发其产生脂质过氧化物（LPO）。精子中除线粒体外，质膜也是内源性ROS主要来源之一[6]。

表2 BTS基础稀释液中添加OPC对精子质膜完整性的影响 %

表3 BTS基础稀释液中添加OPC对精子顶体完整性的影响 %

表4 BTS基础稀释液中添加OPC对精子T-AOC和MDA的影响

本实验发现，猪精液常温保存过程中添加OPC可显著提高精子活率、质膜完整性和顶体完整性，且添加量为50 µg/mL时效果最佳，这一结果与孙艳青等[7]在猪冷冻精液中添加OPC所得结果类似，但在常温保存精液中所需添加浓度略高。产生此差异的原因可能是猪精液冷冻保存过程较复杂，需经过离心、降温、升温等一系列长时间的操作，且在冷冻前会添加冷冻保护剂以减少降温造成的精子机械损伤[8]。冷冻保护剂的添加使得添加40 µg/mL OPC即可清除多余的ROS[7]。但在常温保存环境中，精子代谢持续进行，会产生更多的ROS，且无其余保护剂的协助效应，所以需要添加较多的OPC来清除过量的ROS。因此，在常温保存过程中添加50 µg/mL OPC才有较佳的效果。本实验中，质膜完整率变化随着OPC添加浓度的增加呈先上升后下降的趋势，可能是由于精液在常温保存前期，稀释液中有害物质积累较少，随保存时间的延长，死精子数增加，少量抗氧化剂已不能及时清除产生的ROS，需增大OPC添加量以应对氧化应激；当添加的OPC浓度超过50 µg/mL之后，可能会引发精子凋亡，反而会降低精子质膜的完整性。

本实验中顶体完整率同质膜完整率变化趋势相似，精子顶体是特化细胞器，包裹在精子头部，内含用于穿破透明带的水解酶[9]。当顶体受损后，由于顶体酶、透明质酸酶等提前释放，精子失去穿卵能力，无法与卵细胞结合完成受精，同时很快失去运动能力。精子质膜发生损伤，短时间内不会对精子造成严重影响，主要是由于质膜破损对精子尾部中段运动供能相关蛋白影响有限，不会给精子造成毁灭性打击[10]。本实验结果显示，顶体完整率＞精子活率＞质膜完整率，可印证上述观点。因此，添加适量OPC有助于猪精液常温保存，但过量添加会引发精子凋亡，导致精子活率、质膜和顶体完整性降低等。

3.2 OPC对猪精液中T-AOC活性及MDA含量的影响公猪的生殖系统包括由酶[超氧化物歧化酶（SOD）、磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx）、硫氧还蛋白酶（TRX）、硫氧还蛋白过氧化物酶（PRDX）、对氧磷酶1型（PON-1）和2型（PON-2）]和低分子量的抗氧化剂（L-谷胱甘肽或L-麦角硫因）组成的特殊抗氧化系统[11]。在正常情况下足以维持精液环境中的氧化-抗氧化平衡，但外界环境变化会打破原有的活动秩序，引发脂质过氧化反应，造成精子损伤。ROS的产生会诱导浆细胞构象和完整性发生不可逆损伤，造成DNA损伤并加速细胞凋亡[12]。

本实验结果显示，精子T-AOC随OPC添加浓度升高而增加，MDA含量随添加量升高而降低，与Zhang等[13]在猪精液常温保存中所得结果类似。LPO代谢产生MDA类有害物质越多，精子抗氧化能力越低，受损越严重。综合分析其原因有可能是添加天然抗氧化剂OPC到稀释液中，其结构中的酚性羟基能在液体环境中产生H+，H+作为无电子不稳定的离子，会抢夺自由基上的电子以达到稳定结构，并使自由基失活，降低精子线粒体膜和脂质膜的脂质过氧化反应，保证了精子发挥功能的完整性；另一方面，在本实验中，添加OPC会使精子T-AOC活性增强，且添加量为70 µg/mL时活性最高，在保存第5天时可达1.44 U/mL。可能是由于OPC的添加激活了精液中的SOD、PHGPx、TRX等的活性，从而增强了精子T-AOC活性来保护精子免受氧化应激的损伤。但在此过程中涉及更深层次的机制，还有待进一步研究。

4 结 论

在常温保存稀释液中添加OPC可显著提高猪精液常温保存时间和常温保存质量。当添加量为50 µg/mL时，保存效果最佳，在第5天精子活率、质膜和顶体完整率分别达61.63%、41.88%和75.88%时，T-AOC浓度为1.43 U/mL、MDA含量为2.37 nmol/mL。

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