不同炮制方法对人参皂苷含量及肝癌细胞凋亡的影响

杜瑞雪,郗艳丽,张洋婷,冯小雨,李善姬

(1.吉林医药学院公共卫生学院,吉林 吉林 132013;2.延边大学医学院,吉林 延吉 133002)

人参(Panax ginsengC.A.Meyer),是我国名贵中草药,有“药草之王”之称,传统黑参是用干鲜人参作为原材料,经九蒸九干才能制成[1]。人参皂苷是人参的主要生物活性成分,研究发现人参稀有皂苷具有肿瘤细胞杀伤作用、改善记忆力和抗炎作用[2-3]。特别是人参稀有皂苷Rg3,能够减少肝癌细胞的增殖和转移[4]。目前国内对黑参的研究比较少,国外有研究表明,黑参在促进新血管生成、抗氧化和抗皱等方面疗效好且毒副作用小[5-6]。为了探讨不同炮制方法对人参皂苷含量及抗肿瘤活性的影响,本文制人参、红参和黑参提取液,测定人参总皂苷和稀有皂苷Rg3含量以及探讨其对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制和促凋亡作用,旨在为人参产业发展与人参保健产品开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 市售的五年制人参干品(产地吉林),人肝癌HepG2细胞株(吉林医药学院基础医学院提供)。正丁醇(分析纯);甲醇(分析纯、色谱纯);乙腈(色谱纯);人参皂苷Rg1,Re,Rb1,Rg3对照品(中国药品生物制品检定所);RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜(美国GIBCO公司);四甲基偶氮唑蓝(美国Sigma公司);Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 仪器与设备 Dorim DHC-7000C红参发酵锅(韩国);Agilent1260高效液相色谱仪(安捷伦科技);LC-20AT高效液相(日本岛津公司产品);Symmetrix ODS-R C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm)色谱柱(美国Boston Analytics公司产品);旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂);VP50PLUS旋转蒸发仪(美国莱伯泰科公司);双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司);恒温二氧化碳培养箱(Thermo);全自动酶标仪(Olympus);倒置生物显微镜(Olympus);流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 高效液相色谱条件 以乙腈为流动相A,以水为流动相B。流速:1.0 mL/min,柱温:35℃,检测波长为 203 nm,色谱柱:C18(4.6 ×250 mm,5 μm)。将样品按表1的梯度洗脱条件,按测定方法测定其中的总皂苷Rg1、Re、Rb1和稀有皂苷Rg3含量。

表1 梯度洗脱条件

1.4 标准品溶液的制备及标准曲线的制作 精密称取干燥的人参皂苷Rg1对照品4.06 mg、人参皂苷Re对照品4.38 mg、人参皂苷 Rb1对照品3.94 mg和人参皂苷Rg3对照品4.24 mg,加甲醇配制成10 mL溶液,即得 0.406 mg/mL人参皂苷 Rg1、0.438 mg/mL 人参皂苷 Re、0.394 mg/mL 人参皂苷Rb1、0.424 mg/mL 人参皂苷 Rg3的混合溶液,摇匀,用微孔过滤膜过滤备用。将标准品溶液的原液分别稀释2倍、4倍、8倍、16倍,用HPLC法测定其峰面积,绘制标准曲线。

1.5 供试品溶液的制备 人参于红参发酵锅中蒸制24 h可得红参,蒸制30 h可得黑参,自然干燥备用。人参、红参、黑参提取液制备:在红参发酵锅中分别放入干燥的人参、红参、黑参,加纯净水熬18 h制得人参、红参、黑参提取液,过滤冷藏备用。在过滤液中加水饱和正丁醇萃取3次,收集正丁醇层,然后用旋转蒸发仪蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量筒中,加甲醇至刻度,摇匀,过滤,即得供试品溶液。

1.6 人肝癌细胞HepG2的培养及抑制率和凋亡率检测 细胞培养用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,将实验所得人参、红参、黑参提取液用无血清RPMI-1640培养基稀释浓度为28.8 g/L、14.4 g/L、7.2 g/L、3.6 g/L、1.8 g/L。 取对数生长期细胞,给药组加预先配制好的各浓度药物,置于培养箱中培养48 h。药物作用结束后,每孔加30 μL(5 mg/mL)MTT,置培养箱内培养4 h后吸去孔内上清液,每孔加入 150 μL DMSO,全自动酶标仪于波长570 nm检测各孔吸光度值(A)。用以下公式求药物对细胞的抑制率:抑制率=(正常组A—给药组A)/正常组A×l00%。凋亡率检测时细胞用药物处理48 h,胰酶消化并洗涤,加入100 μL的Binding Buffer缓冲液吹打均匀。加入Annexin V-FITC染液5 μL混匀,避光反应10 min,后加 PI染液5 μL,混匀避光5 min。 加入Binding Buffer缓冲液400 μL,轻轻混匀,1 h内用流式细胞仪检测。

1.7 统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据处理,检测数据以均数±标准差()表示,各组均数间比较前先进行正态性及方差齐性检验,若符合方差齐性,组间比较采用单因素方差分析,处理前后两组间比较采用配对样本t检验方法进行分析。选定P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同炮制方法对人参皂苷含量的影响 人参标品用HPLC法测定峰面积,绘制标准曲线,得到含量与浓度的函数,R2值良好。由图1和表2可知,HPLC法测定的人参不同炮制方法所得提取物主要有人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg3,根据图1中各峰面积及标准曲线计算可得表2,结果显示在人参炮制过程中,人参总皂苷含量由0.56%下降到0.13%,稀有皂苷 Rg3 含量由 0.17% 增加到0.30%,人参总皂苷转化为稀有皂苷Rg3。

图1 不同炮制方法人参皂苷含量色谱图

表2 不同炮制方法皂苷含量变化

2.2 3种提取液对肝癌细胞的增殖抑制作用 与对照组比较,黑参组对肝癌细胞的抑制率明显增加(P<0.05),高于红参组和人参组,抑制率在药物浓度为28.8 g/L时最高,浓度大于3.6 g/L时都有抑制作用,统计分析得黑参提取液的浓度—抑制率回归方程 y=0.033 4x-0.068 9,R2=0.095 73,求得IC50=17.03 g/L。同时发现红参提取液和人参提取液浓度低于28.8 g/L时,对HepG2细胞几乎没有抑制作用(表3)。

表3 三种提取液对人肝癌细胞HepG2的增值抑制作用(,n=6)

表3 三种提取液对人肝癌细胞HepG2的增值抑制作用(,n=6)

∗:与对照组比较,P<0.05;-:与对照组比较,没有抑制作用

__________黑参组 红参组 人参组_______________________________________________________________________OD值(抑制率/%)对照组 0 0.46 ±0.06 0.45 ±0.05 0.46 ±0.04给药组 28.8 0.07 ±0.01(84.8)∗ 0.36 ±0.06(20.0)∗ 0.34 ±0.05(26.1)∗14.4 0.21 ±0.06(54.3)∗ 0.46 ±0.06(-) 0.55 ±0.06(-)7.2 0.41 ±0.07(10.9) 0.51 ±0.02(-) 0.69 ±0.07(-)3.6 0.45 ±0.06(2.17) 0.58 ±0.06(-) 0.61 ±0.06(-)___________________________1.8________________________________________________________________________________________________________0.46_±0.08(-)_0.52_±0.07(-)_0.82_±0.08(-)组别 浓度(g/L)

2.3 3种提取液对肝癌细胞凋亡率的影响 用Annexin V-FITC/PI双染色法测定提取液对肝癌细胞的凋亡作用,与阴性对照组比较,黑参组显著增加人肝癌细胞的晚期凋亡率和总凋亡率(P<0.05),且黑参组对HepG2细胞的晚期凋亡率要强于红参组和人参组。红参组对肝癌细胞的凋亡作用不如黑参组,但强于人参组,主要表现为增加了肝癌细胞的早期凋亡率(P<0.05),人参组对人肝癌细胞的凋亡作用不明显。3种提取液对人肝癌细胞HepG2的凋亡率降低顺序为黑参>红参>人参(表4)。

表4 3种提取液对人肝癌细胞HepG2的凋亡率影响

表4 3种提取液对人肝癌细胞HepG2的凋亡率影响

a:与对照组早期凋亡率比较,P<0.05;b:与对照组中晚期凋亡率比较,P<0.05;c:与对照组总凋亡率比较,P<0.05

___组别 早期凋亡率/% 中晚期凋亡率/% 总凋亡率/%对照组 1.1 ±0.20 2.0 ±0.32 3.1 ±0.50黑参组 24.6 ±6.68 44.8 ±3.38b 69.4 ±8.8c红参组 31.2 ±3.74a 20.0 ±1.95b 51.3 ±4.1c__人参组_________9.27 ±5.27_____________________________________7.63_±6.35_13.6_±5.6

3 讨论

HPLC法是定性定量分析复杂化合物的常用方法,本研究通过此法分析了黑参液中总皂苷和稀有皂苷含量的变化,相较于人参和红参,黑参中稀有皂苷的含量明显增加,有研究表明,稀有皂苷是人参中的主要抗肿瘤成分,Wang[7]研究表明,稀有皂苷Rg5保护小鼠APAP引起的肝毒性;Shin-jung等[8]发现稀有皂苷Rg5通过调控细胞周期相关蛋白诱导乳腺癌细胞凋亡。Dong-Gun等[9]研究发现,人参稀有皂苷Rg3与其他化疗药物在抗肿瘤方面有协同作用。本试验通过MTT法和流式细胞术比较研究明显看出黑参的抗肿瘤活性强于红参和人参,我们有理由怀疑黑参的抗肿瘤活性与其含有的稀有皂苷含量变化有关,在抗肿瘤研究方面可以向人参稀有皂苷方面继续探索,为人参抗肿瘤药物的研究提供了可行思路。

有的研究证明了黑参具有较强的抗氧化能力,也正因为如此其药效要强于普通人参,Bak等[10]发现,黑参通过诱导抗氧化酶活性和抑制MAPK通路来保护HepG2细胞免受氧化应激。Hu[11]研究证明,黑参抑制小鼠体内肝毒性主要与其抗氧化、抗炎、抗凋亡和反硝化有关。Chen[12]发现加味黑参可以提高H22荷瘤小鼠的免疫功能,诱导肿瘤细胞凋亡。通过本次研究发现,黑参的抗氧化作用以及黑参中稀有皂苷抗肿瘤的机制还有待探讨,这也成为本课题组今后的研究方向,可见黑参的药用价值开发仍有很长的路要走。

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[8] Kim S J,Kim A K.Anti-breast cancer activity of Fine Black ginseng(Panax ginseng Meyer)and ginsenoside Rg5[J].J Ginseng Res.2015,39(2):125-134.

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