甘薯病毒病脱毒技术的研究进展

2018-05-09何毅文陈珠李育军何梦海张雄坚植石灿沈文杰秦树香章楷煜倪乔丹

长江蔬菜 2018年8期

何毅文，陈珠，李育军，何梦海，张雄坚，植石灿，，沈文杰，秦树香，，章楷煜，倪乔丹

（1.广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室，广州，510640；2.广东省农业科学院湛江分院；3.华南农业大学农学院；4.深圳市河田姆生物农业创新有限公司；5.湛江市农业科学研究院）

甘薯以营养繁殖方式繁衍后代，感染病毒后，病毒便不断蔓延，最终导致种性退化。据调查，甘薯病毒病导致减产25%左右，有的品种减产达50%以上[1]。目前，国内外还没有有效防治甘薯病毒病的特定农药，也无高抗病毒病的甘薯品种，因此，利用甘薯脱毒苗是防治甘薯病毒病唯一比较有效的途径。

1 试管苗培育技术

1.1 试管苗培育历史概况

植物组织培养技术的发展大概经历了以下3个阶段：①探索阶段（1902-1929年）。19世纪初国外科学家利用植物的细胞、胚、器官等组织进行了不同尝试；1922年，美国医学家Robbins和德国科学家Kotte率先报道离体培养根尖取得了成功。②组织培养技术理论的建立与发展阶段（1930-1959年）。1934年美国科学家怀特等用番茄的根进行组织培养，首次建立了生长旺盛的无性繁殖系，随着探究的不断深入，法国科学家Nobecourt建立了使离体植物组织在人工培养基上不断生长的培养物，奠定了现代组织培养的基础。③快速发展和实践应用阶段（1960年以来至今）。20世纪初该项技术建立以来，在理论研究和应用技术上不断发展，在植物的快速繁殖、品种改良、种质资源保存等方面应用广泛[2]；日本学者中岛和山口于1968年率先进行甘薯组织培养研究，并成功利用离体细胞培养出愈伤组织，由此开启了组织培养技术在甘薯上的应用[3]。

1.2 试管苗培育方法进展

①培养基上的研究新进展传统的植物组织培养技术要求操作环境无菌，操作过程灭菌，因而传统的方法只适用于实验室且需要专业人士严格把控，无形中增加了实验成本，不利于技术推广。随着研究人员对培养基中营养物质、环境适应性的深入研究，提出增加CO2浓度代替糖作碳源，同时在培养基中加入抗菌剂、抑菌剂等物质，简化了植物组织培养工作，而且提高了组培苗的成活率和生长发育速度[2，4]。

②光源上的研究新进展光是影响植物生长的重要因素之一。近年来，在光源方面出现了诸多报道，其中关于LED灯的研究最为火热。LED灯具有体积小、耗电量低、寿命长、高亮度、低热量等优点，因而被人们应用于生产、生活等方面，研究发现其在节能和促进植物生长方面也有明显的优势[5]。但LED灯含有多种有毒元素，废旧的LED灯处理不当会危害环境，此外其发出的蓝光和UV（紫外光）对人体具有一定危害。除LED灯之外，SILHOS和CCFL等新型光源也将是发展的主流。

③与其他技术相结合 a.与细胞融合技术相结合。植物体细胞杂交是将不同科、属、种间的原生质体通过人工诱导融合再培养，创造出新的优良品种的技术[6]。利用甘薯品种间体细胞融合产生的新品种，为甘薯育种提供了新方法[7]。

b.与辐射技术相结合，筛选有利变异体。细胞在分裂过程中受外界如辐射等影响，往往会发生突变，产生变异，可从中筛选出有利变异体，应用于生产。20世纪末陆漱韵等[8]选用浙60-2、徐薯、栗子香3个品种进行辐射，初步获得对线虫性糠腐病抗扩展的变异系。

随着人们对组培的多角度研究，多因子综合控制技术逐渐被应用，该项技术有效降低了生产成本，使组培苗商品化成为可能[4]。

2 甘薯病毒病发生概况及种类介绍

2.1 甘薯病毒病发生概况

自1919年报道甘薯病毒病以来，世界各地相继报道了甘薯病毒病的发生。我国甘薯种植面积大，甘薯病毒病发病率普遍较高，部分品种甚至达90%以上[9]。田间环境复杂，暴发的甘薯病毒病往往为复合侵染型，因此，有关甘薯病毒病的报道中对其名称及症状的描述较为混乱。直到1974年以后，才有部分病毒被纯化鉴定出来，但甘薯病毒病的许多病原至今仍不清楚，有关已分离出的几种病毒分子的研究成果也不多。截至2011年，在甘薯中发现病毒近30种[10]；至2012年，我国甘薯上已确定至少存在8种病毒，但由于缺乏甘薯病毒种类鉴定系统，因而还有多种尚不确定[11]。

2.2 甘薯病毒病的种类介绍

2016年2月6日，我国学者张振臣在邯郸市“第三届中原脱毒甘薯产业发展研讨会”上，对甘薯病毒病的识别及综合防控技术进行了总结。他认为，目前世界上已公开的甘薯病毒有32种，我国有20种，其中发现并命名4个双生病毒新种，6种甘薯病毒中国新纪录种。我国甘薯病毒特点为种类多、新病毒多、一株甘薯上复合侵染现象严重，病毒复合越多，对甘薯的产量影响越大（表1）。目前，甘薯常见的4种主要病毒病及其为害情况见表2。

表1 复合侵染类型及其占比情况

3 甘薯组织培养技术在脱毒方面的应用

3.1 历史概况

1960年Nielsen最先获取甘薯脱毒苗，虽然甘薯脱毒苗培育技术起步晚，但发展迅速。茎尖分生组织培养技术的兴起为病毒病的控制开辟了一条新途径。我国自1985年开展甘薯脱毒研究以来，在甘薯脱毒苗的研究上取得了显著成果。该项技术在我国甘薯栽培史上产生了革命性的影响，成为我国继马铃薯脱毒苗之后生物技术应用于生产的又一典范[9]。

表2 甘薯上发生的4种主要病毒病及其为害情况

3.2 方法研究进展

①脱毒原理通过对植物细胞的研究发现，一方面植物茎尖分生组织中没有维管束系统，病毒在该区域运动困难；另一方面病毒的繁殖必须依赖寄主细胞的代谢过程，但无法与植物分生组织旺盛的代谢活动相竞争。因此，分生区高浓度的生长素可能会影响病毒的繁殖[12，13]。因而，对茎尖无毒区进行离体培养，理论上可得到无毒苗。

②脱毒技术获取无毒或少毒的甘薯茎尖一般采用层剥法，即以在无菌环境下剥取0.2～0.4 mm、并带1～2个叶原基的茎尖为材料。近年研究发现，剥离到还剩5～6层时采用“一刀切”的快速剥离技术，成活率、成苗率比常规技术分别提高219.2%和429.7%[14]。

③热脱毒技术与茎尖培养相结合高温可钝化病毒，抑制病毒生长，降低病毒移动速度，将热处理与茎尖培养技术相结合，可利用高温对病毒的不利影响降低茎尖分生区病毒含量，提高脱毒苗培育的成功性。梁艳荣等[15]研究证明，通过2种技术的结合可以消除常见的马铃薯S病毒（PVS）和马铃薯X病毒（PVX），为甘薯病毒病脱毒技术的应用提供了参考。

3.3 病毒检测技术

甘薯茎尖分生组织培养得到的植株并不都是脱毒苗，只有经过检测，才能投入使用。迄今为止，检测方法主要有以下4种：目测法、指示植物法、酶联免疫吸附法、分子生物学检测技术。

①目测法即用人的肉眼观察判断。该方法主要根据甘薯叶片和块根上表现出的典型症状判断甘薯是否携带病毒。但田间的甘薯病毒往往复合侵染，有些甘薯本身具有耐毒性，因此该方法精确度不高。

②指示植物法将疑似带病苗与其他植物嫁接，观察嫁接后的植株上是否产生枯斑，在一定范围内，枯斑个数与侵染性病毒的浓度成正比，因此可用枯斑数作为检测病毒有无或多少的依据[15]。在甘薯研究中常用巴西牵牛为指示植物，经过近几年的试验发现，甘薯、巴西牵牛试管苗嫁接法可以替代传统的巴西牵牛种子苗网室嫁接法检测甘薯组培苗是否带有病毒，新方法操作简单、灵敏度高、成本低、打破季节和环境的局限[16]。但由于组织培养受无菌环境的约束，该方法不能推广到田间进行。

③酶联免疫法提取样品溶液，自然干燥后按国际马铃薯中心提供的酶联包说明书进行阳性对照。通过对比叶片、叶柄的研究结果，叶柄因含有较少杂质、局限性小而具有较高阳性检出率[17]。但该方法存在假阳性或假阴性的可能，在应用上存在一定局限。

④分子生物学检测法分子生物学方法可分为3种，研究中最常用的为RT-PCR检测技术，利用cRNA探针，通过杂交、扩增目的片段的方法检测病毒的存在。近年来，随着检测样品不断增多，每次只能检测一种病毒，因而该技术已远远不能满足学者们的研究需求，双重RT-PCR检测技术和多重RT-PCR检测技术的出现极大地提高了病毒检测效率[18]。相较于前几种方法，分子生物学方法检测灵敏度高，具有更加广阔的应用前景。

3.4 脱毒技术与组织培养技术的对比

试管苗组织培养技术又叫微型繁殖技术，主要利用植物离体的细胞、器官、组织等材料培育形成新植株，广泛应用于种质资源保护、果树生产、珍稀植物扩大生产、作物脱毒等方面，如北京华楸微型繁殖技术可在短时间内生产大量优质苗木，补充市场需求[19]。茎尖分生组织培养技术是最常用的脱毒技术，可以说脱毒技术是试管苗组织培育技术应用的一个重要方向，同时又是对试管苗组织培育技术的一个深入发展。从研究时长讲，甘薯脱毒技术研究时间比甘薯试管苗组培技术早，直至茎尖分生组织无病或少病被发现，才将两者真正有机结合在一起；从整体来看，有关试管苗组培技术的报道比脱毒技术多，技术上也相对成熟一些；从研究深度讲，脱毒技术的研究进展多停留在对MS培养基的改进以及茎尖无毒组织的提取，而对与其他技术结合（如基因工程）的报道较少，研究深度不如试管苗组织培养技术广。

4 甘薯脱毒技术现存问题及研究展望

培育甘薯脱毒苗可有效消除植物病毒，从而获得不带病毒植株，同时脱毒苗又具有叶面积大、叶绿素多、光合作用强等优势，可使农作物产量增加，品质得到改善。因此，对脱毒技术的深入研究是提高甘薯抗病性、质量、产量的一个重要方法。

目前，随着研究的推进及长期观察发现，甘薯脱毒技术仍存在较多未解决的问题：①病毒变异性强。随着土质、气候的变化及人为或入侵物种的干扰，新的病毒不断产生。②成功的愈伤组织诱导培养条件存在差异，且不适合复制。例如脱毒甘薯一号最佳培养条件为1/2MS+无支持物+LED灯+30 g/L绵白糖+自来水[20]，而烟薯25最适培养基为MS+0.05 mg/L GA+0.04 mg/L IBA[14]。③脱毒苗投入生产不久又会重新感染病毒，脱毒持续时间较短等。

因此，今后需要建立一套完整的病毒防控系统，关键是从探究病原开始对症下药，一方面做好对已知病毒的控制，研究建立更具普遍性的脱毒技术；另一方面通过对现有病毒的分析，做好预防工作。同时，应在深入研究脱毒技术的同时探索与其他生物技术的结合，取其精华剔除糟粕，探索真正适合甘薯生产的相关技术并推广至生产应用。

目前，甘薯病毒病发生严重，且有蔓延恶化趋势，不但影响了甘薯产量，阻碍了甘薯产业发展，而且不利于甘薯种质资源的保存。因此，加强对甘薯病毒病脱毒技术的基础理论和应用技术研究，不仅有望保护甘薯种质资源的物种多样性，促进甘薯产业的健康发展，也为今后甘薯脱毒技术的发展乃至其他生物脱毒技术的研究提供强大的支持，由此可见，甘薯病毒病脱毒技术的研究仍任重而道远。

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