香樟乙醇提取物对茎瘤芥黑斑病的抑制效果及活性成分分析

刘红芳

（长江师范学院生命科学与技术学院，重庆涪陵，408100）

香樟系樟树属的常绿乔木植物，是我国亚热带常绿阔叶林的主要树种之一，属药用植物，具有理气、活血、解表、祛风除湿等功效[1，2]。关于樟树精油的抑菌作用及其化学成分有过许多研究[3～7]，但对于樟树叶乙醇提取物的抑菌效果及活性成分研究不多。本文研究了香樟乙醇提取物对茎瘤芥（榨菜）黑斑病的抑菌活性，并利用气相色谱-质谱联用仪分析了其化学成分，初步明确了香樟乙醇提取物的抑菌活性成分，旨在为植物源抑菌农药新资源的开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

供试的茎瘤芥（榨菜）黑斑病菌为长江师范学院生命科学与技术学院园艺植物病虫害防治实验室从茎瘤芥上分离、纯化、鉴定后保存下来的菌株。无菌条件下将黑斑病菌接入PDA培养基，在25℃条件下暗培养7 d备用。

1.2 香樟乙醇提取物的制备

采用冷浸法提取[8]：采集香樟叶，用清水清洗干净，在室内自然阴干表面水分后放入鼓风干燥箱（45～50℃）烘干直至发脆，装入1 000 mL平底磨口烧瓶内，加入95%乙醇完全浸没香樟叶片，盖上玻璃磨口塞，室温下浸泡5 d后用4层纱布过滤，用旋转蒸发器（55℃）加压浓缩至膏状物，移装于棕色磨口瓶内，放在冰箱中（4℃）备用。

1.3 香樟提取物对茎瘤芥黑斑病的抑制作用

采用生长速率法测定香樟提取物对茎瘤芥黑斑病菌菌丝生长的抑制活性[9]：称取 240、120、60、30 mg香樟提取物，分别加入装有60 mL已经融化的PDA培养基中，提取物在培养基中的浓度分别为 4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL，混匀后倒入直径 9 cm 的培养皿中（每皿20 mL，每个处理3个重复），冷凝后分别接入直径0.8 cm病菌的菌饼，菌丝面向下，置于25℃培养箱内培养，以不加香樟提取物的PDA培养基为对照。培养7 d后测定菌落直径，根据下面公式计算抑制效果。

菌落直径=测量直径-8.0（菌饼直径）；抑制率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

根据不同浓度的抑制率，换算成几率值，各处理的质量体积分数（mg/mL）换成对数值，采用SPSS 17.0软件分析，求出毒力回归方程，算出EC50。

1.4 GC/MS分析条件

①色谱条件 弱极性DB-5MS弹性石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm）。 进样口温度：280℃；升温程序：初温40℃，保持 3min，以3℃/min升至140℃，再以 5℃/min升至 210℃，保持 5 min；载气（He），纯度大于 99.999%，流速 1.2 mL/min；分流进样，分流比50∶1。强极性DB-WAXetr弹性石英毛细管柱（60 m×320 μm×0.25 μm），进样口温度260℃；升温程序同DB-5MS柱；分流进样，分流比100∶1。

②质谱条件 EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围 m/z（荷质比）45～550，四极杆温度 150℃，离子源温度230℃。

1.5 成分鉴定及定量

提取物经质谱扫描后，在色谱工作站得到总离子流量图，检索NISTDEMO标准谱库，进行谱图解析，确定各色谱峰对应的化学成分，采用化学计量学方法对重叠峰进行分辨，用峰面积归一法对各化合物进行定量，计算出各组分的相对含量[10，11]。

2 结果与分析

2.1 香樟提取物对茎瘤芥黑斑病病菌的抑制作用

从表1可以看出，不同浓度的香樟提取物对病菌的抑制作用不同，设置的 4.0、2.0、1.0、0.5 mg/mL 4个浓度对茎瘤芥黑斑病菌生长的抑制率分别是 63%、58%、53%、49%。抑制作用随着设置浓度的减小逐渐下降，0.5 mg/mL时，抑制率不足50%。香樟乙醇提取物4个浓度对茎瘤芥黑斑病菌的抑制作用均与对照差异极显著。

将不同浓度的抑制率换算成几率值，各处理的质量体积分数（mg/mL）换成对数值，用SPSS 17.0软件分析，得出毒力回归方程为=4.840 7-0.304 6 x，EC50为0.299 9，95%置信区间 （%） 为 0.252 6～0.356 1，相关系数（）为-0.997 5。

表1 香樟提取物对茎瘤芥黑斑病菌的抑制作用

表2 香樟乙醇提取物抑菌活性成分分析

2.2 香樟乙醇提取物对茎瘤芥黑斑病的抑制活性成分分析

图1为香樟乙醇提取物的气相色谱，相关化合物的鉴定如表2所示。谱峰出峰时间大都集中在11～19 min。香樟的乙醇提取物中共鉴定出21个化合物，包括烯烃、炔烃、醛、酮、醇、醚、酯等多种成分。其成分主要为酯类化合物，包括饱和脂肪酸酯与不饱和脂肪酸酯：14-甲基十五酸甲酯 （0.41%）、棕榈酸乙酯（13.61%）、十七烷酸乙酯（1.07%）、丁二酸二甲酯 （0.79%）、十七碳烯酸甲酯 （0.20%）、9，12，15-十八碳三烯酸甲酯（42.92%）。另外，石竹烯氧化物（3.90%）、1-环己基丙炔 （7.38%）、2-（1-咪唑基）乙酸（7.25%）、4-甲氧基苯甲醇（3.77%）、叶绿醇（8.46%）等化合物也较丰富。可见，香樟的乙醇提取物的主要成分是含氧化合物，共16个，占提取物总量的79.46%，其中，醛类化合物1个，含量为0.43%；醇类化合物为6个，含量为15.56%；环醚1个，含量为3.90%；饱和脂肪酸酯类4个，含量为15.88%；不饱和脂肪酸酯类化合物2个，含量为43.12%。含氧且含氮化合物2个，含量为10.48%。另外，烯烃、炔烃各1个，含量分别为1.72%、7.38%。由以上分析可总结出，香樟的乙醇提取液中酯类物质居多，且以9，12，15-十八碳三烯酸甲酯、棕榈酸乙酯为主要成分。

图1 香樟乙醇浸提物的GC-MS总离子流

3 小结与讨论

本试验采用生长速率法测定了香樟提取物对茎瘤芥黑斑病菌菌丝生长的抑制活性，发现设置的4个浓度对病菌的生长均有一定的抑制作用，但随着浓度的减小，抑制作用逐渐下降，0.5 mg/mL时，抑制率不足50%。方差分析结果显示，不同浓度处理的茎瘤芥黑斑病病菌直径均明显低于对照。通过气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测香樟叶的乙醇浸提物的化学成分，共检测出21种化合物，包括烯烃、炔烃、醛、酮、醇、醚、酯等多种成分。其成分主要为酯类化合物，包括饱和脂肪酸酯与不饱和脂肪酸酯，占提取物总量的79.46%。

我国樟树资源非常丰富，其乙醇提取物的抑菌活性的研究为提高樟树综合经济效益提供了依据。为了加深樟树作为植物源杀菌剂的开发和利用，应进一步研究其对茎瘤芥黑斑病菌抑菌活性的作用方式和作用机理等，并深入研究其对其他植物病原真菌的生物活性。

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