新麦纤散对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织ATF-4/CHOP表达的影响

付敏军，张君，潘珍珍，郑红斌

浙江中医药大学基础医学院，浙江 杭州 310053

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是发病于肠道黏膜及黏膜下层的慢性炎症性疾病，临床表现多为反复发作的腹痛、腹泻、黏液脓血便及里急后重等症状，可伴有关节、皮肤、眼、口及肝胆等肠外表现。该病临床症状随病变程度而轻重不等，病程迁延不愈，反复发作，甚者并发结直肠癌变，被世界卫生组织列为现代难治病之一[1～2]。早在上世纪中叶，国内就有UC的报道，近年来随着肠镜的推广运用和人们物质生活水平的提高，UC的发病率剧增，但时至今日，其发病机制和有效治疗药物仍在进一步探索中。报道显示免疫细胞、肠上皮细胞的凋亡可导致肠道免疫屏障和机械屏障的损伤，诱导或加重UC病情的发展[3～4]，进一步研究发现内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)可通过激活C/EBP同源蛋白(C/ERP homologous protein，CHOP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)、c-JUN氨基端激酶(JNK)等通路引起细胞凋亡[5～7]。

麦纤散是郑红斌教授在“发芽大麦防治UC的作用机制与临床应用”这一访日留学成果的基础上，结合多年中医药防治UC经验研制而成，目前已获得国家发明专利(专利号：ZL201410138907.4)。相关研究表明该制剂能促进UC大鼠盲肠内容物丁酸和结肠黏膜组织中B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)表达，抑制血清基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)和结肠黏膜组织Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein gene，Bax)表达，修复受损肠道黏膜，对UC具有较好的疗效[8]。为优化此散剂的疗效，针对UC血便症状，增加白及组成新麦纤散。本研究将从内质网应激介导CHOP细胞凋亡途径，观察新麦纤散对UC大鼠结肠组织活化转录因 子 -4(Activating transcription factor-4， ATF-4)和CHOP蛋白和mRNA表达的影响，探析新麦纤散对UC的疗效及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠60只，体质量(200±

20)g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2013-0016，常规饲养于浙江中医药大学动物实验中心，SPF级实验室，实验室环境：恒温，温度(22±1)℃，湿度50%～60%。

1.2 实验药物 精选优质发芽大麦，经去糖化、烘干、碾碎、碱-酶结合法提取麦芽纤维。将优质的山药、茯苓、马齿苋、三七和白及(购于浙江中医药大学中医门诊部)制成超细粉末，过120目标准筛，与麦芽纤维按2∶2∶1∶1∶1∶3质量比充分混匀制成新麦纤散，加蒸馏水配成一定浓度的混悬液，4℃保存备用。美沙拉嗪缓释颗粒(上海爱的发制药有限公司，批号：H20143164)，于研钵中捣碎，加蒸馏水配成一定浓度的混悬液，4℃保存备用。

1.3 实验试剂 葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium，DSS)(美国MP公司，货号：0216011080，分子量36000-50000)，用蒸馏水将DSS粉末配成新鲜的 5%DSS溶液；一抗ATF-4(美国 Cell Signaling Technology公司，货号：11815S)；一抗CHOP(美国Cell Signaling Technology公司，货号：2895T)；RNA提取试剂盒、RT试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]。

1.4 造模、分组及干预 60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、美沙拉嗪组、新麦纤散低、中、高剂量组，每组10只。除正常组外，其余组大鼠饮用5%DSS溶液，代替纯净水自由饮用，保证每天足量，连续饮用1周，当大鼠出现体质量明显下降、泄泻、便血等症状时表明UC模型诱导成功。在此过程中，模型组大鼠因人为因素死亡1只。造模成功后，大鼠与人每公斤体重剂量折算系数为6.25，美沙拉嗪组灌胃美沙拉嗪缓释颗粒混悬液0.42 g/(kg·d)，新麦纤散低、中、高剂量组分别灌胃新麦纤散混悬液1.5、3、6 g/(kg·d)，其余组大鼠予等体积生理盐水灌胃，连续干预2周。

1.5 标本采集 末次给药24 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉解剖大鼠；肉眼观察结肠组织，选取病变严重部位，一部分置于10%福尔马林溶液中固定，一部分放入冻存管，保存于液氮中。

1.6 病理切片观察及组织病理学评分 取大小约为2.0 cm×1.0 cm×0.3 cm的结肠标本，梯度脱水，石蜡包埋、切片、HE染色后，观察并评估各组结肠组织的病理变化，评分标准见表1。

表1 组织病理学评分标准

1.7 Western Blot法检测结肠组织ATF-4、CHOP蛋白的表达 结肠组织蛋白提取变性后上样，每孔上样总蛋白量为40 μg，电泳转膜后，加一抗、二抗，室温孵育1 h，显色曝光，采用β-actin作为内参蛋白，以灰度值比值表示蛋白相对表达水平。

1.8 RT-PCR法检测结肠组织ATF-4、CHOP mRNA的表达 取大鼠结肠组织约20 mg，参照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，逆转录后用实时荧光定量PCR仪进行扩增，扩增反应条件为：95℃，3 min；95℃，10 s，60℃，30 s(48 个循环)。Bio-Rad iQ5 PCR仪收集反应结果，利用公式2-△△CT计算ATF-4、CHOP的转录水平。引物设计、合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成，其序列见表2。

1.9 统计学方法 采用SPSS18.0进行分析处理，计

表2 引物序列

量资料以(x±s)表示。若符合正态分布，采用单因素方差分析进行组间比较；若不符合正态分布，则采用非参数秩和检验进行分析比较。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况 正常组大鼠精神状态良好，毛发有光泽，动作敏捷，饮食正常；大鼠饮用DSS后出现体质量减轻，有腹泻、血便等症状，后期症状加重，肛周有污秽物黏附，精神差、饮食不佳等症状。新麦纤散治疗后，UC大鼠血便、腹泻症状均有不同程度的改善，体质量增加，动作较正常。

2.2 各组大鼠结肠组织病理切片观察 见图1。正常组大鼠结肠黏膜完整，未见溃疡、水肿，也无炎症细胞浸润。模型组则见杯状细胞畸形、减少，腺体排列不规则，淋巴细胞浸润明显。经新麦纤散和美沙拉嗪干预后，未见或少见溃疡、中性粒细胞等炎症细胞浸润，腺体也有不同程度的改善，其中新麦纤散中、高剂量组和美沙拉嗪组好转较为明显，优于新麦纤散低剂量组。

图1 各组大鼠结肠组织病理切片观察 (×200)

2.3 各组大鼠结肠病理损伤评分比较 见表3。与正常组比较，模型组大鼠结肠病理损伤评分显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，美沙拉嗪组、新麦纤散低、中、高剂量组大鼠结肠病理损伤评分显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 各组大鼠结肠组织ATF-4、CHOP蛋白表达水平比较 见图2、表4。与正常组比较，模型组大鼠结肠组织ATF-4、CHOP蛋白表达增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，美沙拉嗪组和新麦纤散中、高剂量组ATF-4、CHOP蛋白减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组大鼠结肠病理损伤评分比较(±s) 分

表3 各组大鼠结肠病理损伤评分比较(±s) 分

与正常组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组 别正常组模型组美沙拉嗪组新麦纤散低剂量组新麦纤散中剂量组新麦纤散高剂量组n 10 9 10 10 10 10评分0.00±0.00 2.33±0.50①0.60±0.21②0.90±0.46②0.65±0.24②0.70±0.26②

图2 各组大鼠结肠组织ATF-4、CHOP蛋白表达结果

表4 各组大鼠结肠组织ATF-4、CHOP蛋白表达水平比较(x±s)

2.5 各组大鼠结肠组织ATF-4、CHOP mRNA表达比较 见表5。与正常组比较，模型组大鼠结肠组织ATF-4、CHOP mRNA表达增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，美沙拉嗪组和新麦纤散低、中、高剂量组大鼠结肠组织ATF-4、CHOP mRNA表达减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

UC的发病与免疫、遗传等因素相关，研究发现其与内质网介导的细胞凋亡关系也十分密切。内质网是调节蛋白质合成、加工、转输、脂质合成、维持钙离子稳定的一个重要细胞器，对内外环境的改变十分敏感，理化因素、缺氧缺血、病原微生物等均可导致大量未折叠或错误折叠的蛋白聚集，钙离子平衡失调，诱发ERS，此时内质网将启动未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，通过激活蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase related endoplasmic reticulum kinase，PERK)、 肌 醇 需 求 酶 1(inositol requiringkinase1，IRE1)、活化转录因子-6(activatingtranscription factor-6，ATF-6)3种跨膜蛋白及其相关下游靶点，维持内质网功能的正常运转，对内质网进行自我修复和保护。然而长时间或高强度的应激将会介导CHOP等细胞凋亡途径，诱导内质网细胞的凋亡，致使受损肠道黏膜屏障修复困难，引起UC反复发作、病程缠绵[9～10]。ERS激烈持续时，作为与UC关系最为密切的通路，PERK发生自身磷酸化而被活化，进而激活ATF-4，协调氨基酸的生物合成和转运，增加伴侣分子的合成，促进抗氧化应激反应，上调蛋白分泌相关基因的表达，同时转移到细胞核的ATF-4作用于下游的转录靶点CHOP，促进CHOP蛋白的大量表达，使应激的细胞进入了凋亡阶段[11～14]。

表5 各组大鼠结肠组织ATF-4、CHOP mRNA表达比较(x±s)

UC归属中医休息痢、肠澼等范畴，古往今来，历代学者对其均有研究。中医学认为，UC发病本于脾胃虚弱，湿浊内生，湿、热、瘀毒杂合为其标，病位在肠道。脾胃虚弱，兼或外感湿邪，或进食辛辣，导致湿热蕴结肠道，搏击气血，致使肠络受损，出现黏液脓血便、腹泻等症状。新麦纤散正是基于此病因病机配伍而成，方中麦芽消食助运，茯苓、山药化湿和中，补脾固肠，马齿苋清肠解毒止痢，三七、白及止血排脓、化瘀敛疮，全方共奏健脾固肠化湿、清肠解毒化瘀之功。

实验结果显示，模型组大鼠结肠组织病理改变严重，ATF-4、CHOP蛋白和mRNA的水平均升高(P＜0.05)，表明UC大鼠肠道黏膜细胞已进入凋亡状态。新麦纤散中、高剂量组治疗后，UC大鼠血便改善，精神好转，结肠组织炎症和损伤减轻，ATF-4、CHOP蛋白和mRNA的表达均减少(P＜0.05)，这表明新麦纤散可能通过抑制结肠组织ATF-4、CHOP蛋白和mRNA的表达，减少肠道黏膜细胞的凋亡，对UC大鼠起到保护作用。

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