猪伪狂犬病病毒gE蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

寇晓晶，高 峰，郭慧琳，刘剑锋

（1.甘肃省动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730000；2. 盐城出入境检验检疫局，江苏盐城 224002；3. 南京农业大学，江苏南京 210014）

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种疱疹病毒，能够感染猪、牛、羊等家畜及野生动物，主要侵害神经系统及生殖系统，降低家畜的生产性能，甚至导致动物死亡。据不完全统计，全世界范围内己有44个国家和地区报道过伪狂犬病的发生。

猪是PRV的天然宿主，各个阶段猪均可感染。新生仔猪感染后呈现神经症状，且死亡率极高；妊娠母猪、种公猪以繁殖障碍为主；生长育肥猪则表现为呼吸道症状[1-2]。一旦猪群发生PRV感染，病毒很难被清除。猪伪狂犬病因传播速度快、范围广、途径多，以及病原顽固等特点，被定义为极难防疫的自然疫源性疾病，国际动物卫生组织（OIE）将其列为须报告动物疫病。目前，一些欧洲和北美国家通过积极有效的疾病防控手段和扑杀程序，已将PRV彻底净化。但PRV在我国仍广泛流行，引起的经济损失巨大。

目前PRV的诊断方法主要有病毒分离培养、PCR、血清抗体检测等[3-7]。但病毒分离培养耗时较长，一般需要耗时2～3 d，并且敏感性较差；PCR是一种快速、精确、敏感的检测方法，但对专业技能要求较高，且设备昂贵，不适用于临床推广[8-9]。相比上述两种检测方法，血清抗体检测具有操作简单、敏感性好、能大批量检测样品的优点，更能符合临床检测需要。

根据疮疹病毒糖蛋白命名法，PRV的糖蛋白统一命名为gB、gC、gD、gE、gH、gJ、gK、gL、gM、gN，其中gE是主要的毒力因子。病毒在体外培养时，gE的缺失并不影响其增殖性能和免疫原性，但病毒毒力则会降低，从而为该病疫苗制备提供了思路[10]。目前，几乎所有分离到的野毒株中都含有gE蛋白[11]。当动物自然感染PRV时，血清中的gE抗体则会升高，而gE蛋白缺失疫苗免疫后则不会产生gE抗体。因此，选择gE蛋白作为包被抗原，可用于猪群野毒感染的临床检测。

本研究以gE蛋白为包被抗原，建立了PRV野毒株ELISA检测方法，并通过与国际知名产品进行对比试验和稳定性试验，确定该方法可用于猪伪狂犬病检测。

1 材料与方法

1.1 材料

PRV原核表达重组gE纯化蛋白：由本公司合成、表达及纯化；辣根过氧化物酶（HRP）羊抗猪：购自亿米诺公司；TMB底物显色液：本公司自备；胎牛血清：购自美国Gibco公司；96孔可拆式酶标板、酶标仪：购自美国Thermo公司；猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体ELISA检测试剂盒：购自于美国IDEXX。其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 gE蛋白间接ELISA的建立及优化 对抗原包被量、抗原包被条件、封闭液成分、孵育温度、样品稀释液，以及二抗稀释液成分和稀释度等进行优化，根据P/N值建立最佳条件。

1.2.2 gE蛋白间接ELISA反应体系的确立 取酶标板，将待检血清作1∶50稀释，取100 µL加至酶标板中。同时设阴、阳性对照各2孔，各取阴阳性对照100 µL 加入孔中（不用稀释）。轻轻振匀孔中样品，盖上盖板膜，置室温下温育30 min。弃去孔中溶液，每孔加入稀释好的洗涤液260 µL，静置30 s后，弃去洗涤液；洗涤4次后在吸水纸上拍干。配制酶结合物工作液：按1∶100比例，混匀。每孔加酶结合物工作液100 µL，盖上盖板膜，室温（25±2）℃下温育30 min。弃去孔中溶液，洗涤4次后在吸水纸上拍干。将底物A液与底物B液按1∶1混合均匀，加入孔中（100 µL/孔），盖上盖板膜，室温下反应10 min。每孔加入终止液50 µL，5 min内于OD450/630nm处测定结果。

1.2.3 gE蛋白间接ELISA阴阳性判定标准的建立 利用建立的方法，检测阴阳性对照血清OD450/630nm差值，并各检测20份阴阳性血清OD450/630nm差值，分别计算出阴阳性对照血清的平均OD值，以S/P值作为判定阴阳性标准。

1.2.4 与国外标杆产品的比对 用本自制产品与美国IDEXX公司产品，对246份猪血清分别进行检测，然后分析本自制产品的敏感性、特异性和符合率。

1.2.5 gE蛋白抗体检测试剂盒稳定性试验 4 ℃条件下，用同一份血清检测OD450/630nm差值以及阴阳性对照血清OD450/630nm差值。检测时间分别为0 d、15 d、1个月、3个月、6个月及12个月。计算3批次的S/P值，探究试剂盒的有效期。

2 结果

2.1 gE蛋白间接ELISA阴阳性判定标准的建立

利用建立的PRV gE蛋白间接ELISA方法，检测阴性对照血清、阳性对照血清、20份阴性血清和20份阳性血清的OD450/630nm差值。具体结果见表1。统计发现，阴性对照OD450/630nm平均差值为0.068，阳性对照为2.782。根据公式S/P=（样本OD值-阴性对照平均值）/（阳性对照平均OD值-阴性对照平均值），以及阴阳性血清的检测结果，初步确定S/P≥0.15为阳性，S/P＜0.15为阴性。

2.2 与美国IDEXX公司产品的比对

与美国IDEXX公司产品完成了246份临床样本的比对试验，证明本自制的ELISA产品与该国外标杆产品的阳性符合率为88.03%，阴性符合率为91.47%，总体符合率为89.84%（表2）。

表1 ELISA检测猪血清结果（OD 450/630 nm差值）

表2 与国外进口标杆品牌符合度对比结果 单位：份

2.3 gE蛋白抗体检测试剂盒的批间、批内重复性

分别用3个批次组装的试剂盒检测5份血清的OD450/630nm差值，发现批间变异系数（CV）在3.44%～6.05%之间，均小于10%，表明PRV gE蛋白抗体检测试剂盒不同批次间的重复性较好（表3）。

表3 批间重复性试验结果

使用同批次组装的试剂盒检测与上相同的5份血清，根据OD450/630nm差值标准差和变异系数，分析批内重复性，发现批内变异系数在2.14%～8.67%之间，均小于10%，表明PRV gE蛋白抗体检测试剂盒同批次内的重复性较好（表4）。

表4 批内重复性试验结果

2.4 gE蛋白抗体检测试剂盒4℃保存试验

4 ℃条件下，0 d、15 d、1个月、3个月、6个月和12个月的保存试验结果见表5。保存试验显示，4 ℃条件下，12个月的S/P值基本恒定，故可以保存12个月。

表5 4 ℃条件下保存试验（S/P值）

3 讨论

PRV目前在国内猪场广泛流行，仔猪感染后呈急性发病并大量死亡，成年猪感染后临床症状各异，包括脑炎、肺炎、流产，同时造成猪机体免疫力下降，对畜牧业威胁极大。目前伪狂犬病的防控主要靠gE基因缺失疫苗免疫。采用gE-ELISA对猪群进行血清抗体检测，可以有效区分疫苗抗体及感染抗体，对猪场伪狂犬病的防控具有重要意义。目前市面上很多gE-ELISA检测试剂盒是基于5个抗原表位中1个或者2个建立的阻断ELISA。但是gE抗原显示出一定的抗原漂移性，并且猪个体之间对gE不同表位的抗体应答也显示出多样性，因此阻断ELISA可能会出现一些误判[12-13]。鉴于这种情况，检测全蛋白抗体的结合性ELISA，如间接ELISA或夹心ELISA则较有优势。这种方法不会受到gE表位特异性变化的影响。虽然gE蛋白在异体表达系统里面很难完全表达[14]，但是随着对PRV gE蛋白的研究，其表位已被分析清楚[15]。

本研究通过原核表达gE蛋白中具有免疫原性抗原决定簇的基因片段，使包被抗原具有较好的敏感性及特异性。产品比对试验中，将自制的间接ELISA方法对比国外的标杆产品，显示阳性符合率为88.03%，阴性符合率为91.47%，说明建立的间接ELISA方法敏感性和特异性良好；生物统计学显示，不存在显著性差异。同时，该检测方法在时间上比国外标杆产品缩短了近半个小时，更有利于在我国动物疫病防控一线市场推广应用。

4 结论

本研究以原核表达的PRV gE蛋白为包被抗原，通过建立并优化间接ELISA方法，研制出了PRV间接ELISA抗体检测试剂盒。与美国IDEXX生产的标杆产品对比发现，该试剂盒的阳性符合率为88.03%，阴性符合率为91.47%，总体符合率为89.84%。批间和批内重复性试验表明，该试剂盒变异系数均小于10%，具有较好的重复性。该检测试剂盒为猪场PRV野毒感染检测提供了技术支撑，可用于猪场PRV野毒感染的临床检测。

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