5种氮源对蛹虫草生长及其质量的影响

李 菲，王 忠，卞文印，钟李凤

[安发(福建)生物科技有限公司， 福建 宁德 352100]

蛹虫草又名北冬虫夏草，属于真菌门、子囊菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属[1]。蛹虫草含有丰富的生物活性成分，如虫草素、虫草酸、虫草多糖等，其中虫草素是一种核苷类抗生素，能抑制 mRNA 合成，诱导细胞凋亡 ，使细胞分化，对多种肿瘤细胞的生长具有抑制作用，尤其是对某些类型的白血细胞抑制作用更为明显[2-3]；虫草多糖可提高人体免疫功能，已临床用于治疗恶性肿瘤[3-4]。氮源作为蛹虫草生长必需的营养成分之一，对蛹虫草生长有着非常重要的作用。本试验系统研究氮源对蛹虫草子实体生长及虫草素、虫草多糖含量的影响，以寻找适宜蛹虫草生长及虫草素、虫草多糖积累的氮源，为生产富含虫草素、虫草多糖的蛹虫草提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蛹虫草菌种Cmα-001，由安发(福建)生物科技有限公司研发中心实验室提供。

葡萄糖、蔗糖、琼脂、硫酸镁、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、蚕蛹粉、牛肉膏、黄豆粉、酵母粉、硫酸铵、虫草素、甘露醇标样、甲醇(色谱纯)、四氢呋喃(色谱纯)、无水乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、苯酚(分析纯)等。

SW-CJ-1A超净工作台，SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱，TES1330A照度计，MS6508数显温湿度计，Waters高效液相色谱仪，Waters2487紫外检测器，Part No.wato45905C18(4.6 mm×150 mm)色谱柱，汉邦C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱，0.5 μm水相微孔滤膜，恒温水浴锅，722分光光度计。

1.2 试验处理

用于菌种分离培养的斜面培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、MgSO40.5 g、KH2PO41.0 g、VB10.1 g，pH自然值；用于培养菌丝体的液体培养基：马铃薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、蛋白胨5.0 g、MgSO41.0 g、KH2PO42.0 g、VB10.1 g，pH自然值，分装至三角瓶；用于栽培的培养基：大米32 g、营养液42 mL (蔗糖20 g、 MgSO41.0 g、KH2PO42.0 g、 VB10.1 g、水1000 mL，pH自然值)，以不加氮源作为对照(CK)，5个试验处理分别加入10 g·L-1的蛋白胨、牛肉膏、黄豆粉、蚕蛹粉、酵母粉作为氮源，分别编号为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ，研究不同氮源对蛹虫草整个生长过程、产量，以及对虫草多糖、虫草素含量的影响。

1.3 栽培方法

栽培种制备：将蛹虫草母种进行分离，接种至斜面试管，放置于生化培养箱中18℃培养，从培养的第4 d开始，每天进行10 h光照培养，7 d左右获得生产菌种。

液体种制备：在超净工作台下，将试管菌切成小碎块，接种至液体培养基中，温度20℃下静置培养48 h，后置于摇床内130 r·min-1下进行振荡培养，3 d左右获得液体接种菌。将液体菌种稀释5倍，即可用于接种大米培养基。

接种后搬进培养室内，温度18～20℃下黑暗培养5 d左右，至菌丝吃透培养基；发菌完成后开始进行弱光照培养，在光照度200～400 lx、光照时长10～12 h·d-1、温度20℃、相对湿度70%～80%条件下培养4 d左右，至培养基完全转为橙色；之后进入原基分化阶段，温差控制在5～10℃，培养5 d左右，至有较多小刺尖状突起形成；之后进入子实体生长阶段，温度22℃，相对湿度80%～90%，光照700～1 000 lx，每日光照10 h·d-1，培养35 d左右，采收时60℃烘干。

1.4 虫草素、虫草多糖含量的测定

高效液相色谱条件：C18柱，250 mm×4.6 mm(i.d.)，5 μm，流动性：乙腈∶水为5∶95，用前过0.45 μm滤膜，脱气。流速：1.0 mL·min-1，柱温：35℃，波长：260 nm，进样量：10 μL。

虫草素标准曲线制定：准确吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL和5.0 mL的标准液于10 mL容量瓶中，用水定容、摇匀，该标准曲线浓度设为1.00、2.00、5.00、10.0、20.0和50.0 μg·mL-1，按色谱条件测定，以虫草素质量为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，计算标准曲线，求线性回归方程。

提取虫草多糖：取每组样品粉末，以无水乙醇提取10 h除去脂溶性成分，自然风干，取脱脂后的残渣，水浴70℃恒温提取2次，过滤，取滤液减压浓缩，浓缩液以Savag法除去蛋白质，最后移入100 mL的容量瓶中，冷却定容备用。

葡萄糖标准曲线绘制：精确称取葡萄糖200 mg置于100 mL容量瓶中，定容摇匀，取1 mL溶液溶于50 mL容量瓶中定容摇匀，备用。分别吸取标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,用蒸馏水补充至2.0 mL，加入6%的苯酚溶液1 mL，静止10 min,摇匀静置20 min，于490 nm处测定吸光值，以2.0 mL蒸馏水作为空白，获得回归方程：A=0.0089C+0.0117，r=0.9950。其中，A为吸光值，C为葡萄糖浓度。

精确吸取样品处理液1.0 mL置于10 mL比色管中，加水补足至2.0 mL，样品管和空白管中加入苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加浓硫酸5.0 mL，摇匀放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温，以空白校正零点，于490 nm处用1.0 mL比色皿测吸光度[5-6]。

2 结果与分析

2.1 5种氮源对蛹虫草发菌的影响

由表1可知，添加蛋白胨、蚕蛹粉的菌丝健壮、浓密、洁白，菌丝生长速度较快，且菌丝生长速度显著高于添加牛肉膏、黄豆粉、酵母粉处理。对照处理蛹虫草菌丝生长速度显著低于各添加氮源处理。说明适当添加氮源有利于蛹虫草菌丝生长。

表1 不同氮源对蛹虫草发菌阶段的影响

注：表中所列数据为平均值±标准差;同列数据后不同小写字母表示其在0.05水平下差异显著，下表同。

2.2 5种氮源对蛹虫草子实体生长的影响

由表2可知，添加氮源处理蛹虫草子实体的畸形率显著低于对照；添加氮源处理蛹虫草子实体的平均高度显著高于对照。除处理Ⅵ外，各处理的出草率均显著高于对照。说明添加氮源有利于子实体生长，且以添加蚕蛹粉处理最佳，其次是添加蛋白胨处理。除处理Ⅵ外，各处理的干品产量均显著高于对照，且添加蚕蛹粉处理干品产量最高。

表2 5种氮源对蛹虫草子实体生长的影响

2.3 5种氮源对虫草素及虫草多糖含量的影响

由表3可知，与对照处理相比，添加氮源处理虫草素的含量及产量、虫草多糖的含量与产量均增加，说明添加氮源更有利于虫草素、虫草多糖的积累。添加蚕蛹粉处理的虫草素含量及产量均明显高于其他处理，蛋白胨次之。添加蛋白胨处理的虫草多糖含量显著高于其他氮源处理，添加蚕蛹粉处理的虫草多糖产量显著高于其他处理。

表3 5种氮源对虫草素及虫草多糖含量的影响

3 讨论

添加氮源对蛹虫草整个生长过程都有很大的促进作用，且以添加蛋白胨和蚕蛹粉处理更有利于蛹虫草生长，子实体产量和质量均较高，虫草素的含量与产量，虫草多糖的含量及产量均相对较高。说明添加蛋白胨和蚕蛹粉均能促进蛹虫草的生长及有效成分的积累。添加蚕蛹粉处理的虫草素含量及产量均最高，分别达到(7.93±0.092)mg·g-1和每瓶(34.06±0.158)mg。添加蛋白胨处理虫草多糖含量最高，达到(21.36±0.076)mg·g-1，但由于子实体产量相对添加蚕蛹粉处理低，造成虫草多糖产量低于添加蚕蛹粉处理；添加蚕蛹粉处理的虫草多糖产量最高，每瓶达(103.85±0.169)mg。因此，建议添加蚕蛹粉作为氮源，更适合高产量、高质量蛹虫草的栽培生产。

参考文献：

[1]郑壮丽,黄春花,梅彩英,等.蛹虫草国内外研究的新进展[J].环境昆虫报，2011,3(2):225-233.

[2]曾照芳,罗光丽.虫草素临床应用研究概述[J].实用中医药杂志,2010,26(9)：666-668.

[3]张平,朱述钧,钱大顺,等.北冬虫夏草功能成分及保健作用分析[J].江苏农业科学,2003(6):105-107.

[4]CHO H J，CHO J Y ，RHEE M H ，et al.Cordycepin(3-deoxyaden sine)in hibits human platelet aggregation acyclic AMP and cyclic GMP-dependent manner[J]．European Journal of Pharmacology，2007，558(1)：43-51.

[5]王蕾,于荣敏,张辉,等.人工培养蛹虫草多糖的分离纯化及其结构的初步研究[J].中国生化药物杂志, 2003(1): 23-25.

[6]卢晓岩.硫酸-苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量[J].食品工业科技,2002，23(4):69-70.