3种血浆微小RNA提取方法的评价

黄学文， 潘 杰， 赵兰静， 吴 茵， 朱菊平

（华东疗养院检验科，江苏 无锡 214065）

目前，在人体内已发现700多种微小RNA（microRNA，miRNA）。功能学研究结果显示，miRNA 参与调控几乎所有细胞生命活动过程，在人类多种病理条件下均会发生表达量的变化，目前已被广泛用于肿瘤、血液病和心血管疾病等的研究中，并可能成为疾病治疗新的靶标和无创性诊断新的分子标志物[1-3]。

随着血浆（血清）游离miRNA在临床上的应用越来越广泛，血浆（血清）游离miRNA提取显得越来越重要。游离miRNA在正常人的血液中含量甚微，获得高浓度、高质量的游离miRNA是进行分子生物学研究的第一步，也是关键的一步。本研究对目前miRNA提取常用的2种方法即柱分离方法和TRIzol提取方法进行评价，以期掌握更好、更经济的miRNA提取方法，为下一步实验提供方法学依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取20名2016年10月20日来华东疗养院体检的志愿者作为研究对象，年龄35～55岁。全部研究对象乙型肝炎病毒血清标志物和丙型肝炎病毒血清抗体均为阴性，肝功能、肾功能、血脂和尿酸等生化指标正常，超声波检查证实肝、胆、脾、胰、肾无异常，X线、电子计算机断层扫描及内窥镜检查均正常。

1.2 方法

1.2.1 血浆的制备 采集所有研究对象体检时的空腹静脉血3 mL，加入含乙二胺四乙酸的BD抗凝管中，4 ℃ 1 900×g离心10 min，转移上层血浆至新的1.5 mL Eppendorf管中，然后4 ℃ 16 000×g离心10 min，吸取上清-80 ℃保存备用。

1.2.2 TRIzol法提取miRNA 取500 μL血浆，按照TRIzol试剂盒（美国Life公司）说明书进行RNA提取并溶解于35 μL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarborate，DEPC）水中，-80 ℃保存备用。1.2.3 进口硅胶吸附柱法提取miRNA 取200 μL血浆，用miRNA Neasy血清/血浆试剂盒（德国Qiagen公司）按说明书提取RNA并溶解于14 μL DEPC水中，-80 ℃保存备用。

1.2.4 国产硅胶吸附柱法提取miRNA 取200 μL血浆，按照血浆/血清miRNA提取试剂盒（江苏然科生物技术有限公司）说明书提取RNA并溶解于14 μL DEPC水中，-80 ℃保存备用。

1.2.5 提取物中β-globin基因的检测 用TaqMan聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）体系（日本Takara公司）检测提取的RNA中的β-globin基因。具体步骤如下：2×PCR缓冲液12.5 μL，10 μmol/Lβ-globin基因上、下游引物各0.5 μL，10 μmol/L TaqMan-BHQ1探针0.75 μL，50×ROX 0.25 μL，DEPC水0.5 μL，提取物10 μL，总体积25 μL。扩增条件：95 ℃30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40个循环。β-globin基因的上、下游引物及TaqMan-BHQ1探针由上海英骏公司合成，序列见表1。

1.2.6 逆转录 用逆转录体系（美国Life公司）进行逆转录合成cDNA，体系中包括：100 mmol/ L脱氧核糖核苷三磷酸0.15 μL、50 U/μL逆转录酶1 μL、10×逆转录缓冲液1.5 L、20 U/μL RNA酶抑制剂0.19 μL、10 μmol/ L miRNA-21反转录茎环引物3 μL、DEPC水4.16 μL、提取物5 μL、总体积15 μL。混合体系放置冰上5 min，然后放入PCR仪进行逆转录。逆转录反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。逆转录产物置-20 ℃保存备用。miRNA-21反转录茎环引物由上海英骏公司合成，序列见表1。

1.2.7 TaqMan-MGB探针检测miRNA-21 用TaqMan-MGB探针PCR体系（江苏昱安生物科技有限公司）进行miRNA-21检测。荧光定量体系中包含：反应缓冲液4 μL，10 μmol/L miRNA-21上、下游引物各0.6 μL，10 μmol/L TaqMan-MGB探针0.4 μL，DEPC水12.15 μL，逆转录产物2 μL，50×ROX 0.25 μL，总体积20 μL。荧光定量PCR扩增条件：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。miRNA-21上、下游引物及TaqMan-MGB探针由上海英骏公司合成，序列见表1。

1.3 仪器

Heraeus Fresco 17/21冷冻微量离心机（美国Thermo公司），micromax微量离心机（美国Thermo公司），Bioer MB-102振荡恒温金属浴（杭州博日公司），ABI ViiA 7DX荧光定量PCR仪（美国Life公司），ABI VERITI梯度PCR仪（美国Life公司）。

表1 引物及探针序列

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析及q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法提取物中β-globin基因的检测

国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法提取物中β-globin基因的Ct值分别为35.487±0.356、35.591±0.332和33.529±0.499，3种方法差异有统计学意义（P＜0.001）。国产和进口硅胶吸附柱法β-globin基因Ct值均明显高于TRIzol法（P＜0.000 1），而国产和进口硅胶吸附法β-globin基因Ct值差异无统计学意义（P=0.345 4）。

2.2 国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的检测

采用TaqMan-MGB探针qPCR 检测miRNA-21。国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法miRNA-21的Ct值分别为26.527±0.158、26.653±0.201和28.169±0.385，3种方法差异有统计学意义（P=0.000 3）。国产硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值低于进口硅胶吸附柱法（P=0.033 7），国产和进口硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值均明显低于TRIzol法（P＜0.000 1）。

3 讨论

miRNA是一类长约19～24 nt的非编码单链小RNA 分子，在大多数真核生物中表达，参与多种生物学信号通路的调节，组织或血清中miRNA 的异常表达与多种人类恶性肿瘤密切相关。越来越多的证据表明，差异表达的miRNA可作为疾病早期诊断、分子分型及预后判断的指标，同时也可作为多种疾病，特别是肿瘤新的治疗靶标。目前，miRNA已成为分子生物学、遗传学和临床医学等领域的研究热点[4-5]。

随着血浆（血清）游离miRNA在临床上的应用越来越广泛，血浆（血清）游离miRNA提取显得越来越重要。目前，miRNA提取方法主要有TRIzol法和柱分离方法。TRIzol法基本沿用了mRNA 的分离技术，未考虑miRNA与mRNA在物理性质和存在方式上的差异，如miRNA在长度上远小于mRNA。此外，miRNA在细胞中主要以蛋白复合体的方式存在，因此TRIzol法容易造成miRNA大量丢失[6]。随着材料学的发展，柱分离提取方法可在一定程度上解决上述问题，但柱提取方法成本太高，约为TRIzol法的10倍，并且多为国外公司所垄断。近年来，随着技术的进步，国内的柱分离提取方法已经取得了长足的进步。

为了筛选更好、更经济的miRNA提取方法，为下一步实验提供新的选择，本研究采用国产、进口硅胶吸附柱法和TRIzol法分别提取20名志愿者血浆中的miRNA，比较3种方法提取的miRNA纯度和浓度。根据文献报道，血浆β-globin基因浓度可以代表DNA的量，因此可用TaqMan-BHQ1探针qPCR检测提取物中的β-globin基因含量，以观察RNA提取的纯度。本研究结果显示，国产和进口硅胶吸附柱法提取物中的β-globin基因Ct值明显高于TRIzol法（P＜0.000 1），说明硅胶吸附柱法提取的miRNA纯度较高，并且2种硅胶吸附柱法的β-globin基因Ct值均＞35，表明这2种方法提取的miRNA中的DNA量极低，提取的miRNA纯度很高。另外，国产和进口硅胶吸附柱法提取物中的β-globin基因Ct值差异无统计学意义（P＞0.05），说明国产硅胶吸附柱法提取的miRNA纯度也能达到进口硅胶吸附柱法的提取纯度。为了观察提取的miRNA浓度，本研究利用反转录茎环引物及TaqMan-MGB探针qPCR检测3种方法提取物中miRNA-21的Ct值。结果显示，国产和进口硅胶吸附柱法提取物中miRNA-21的Ct值均明显低于TRIzol法（P＜0.000 1）。这进一步说明TRIzol法易造成miRNA丢失，硅胶吸附柱法能有效改善miRNA的提取效率[6]。国产硅胶吸附柱法miRNA-21的Ct值高于进口硅胶吸附柱法（P=0.033 7），说明国产硅胶吸附柱法提取的miRNA浓度稍高于进口硅胶吸附柱法。

综上所述，硅胶吸附柱法提取miRNA在提取纯度和浓度上均优于传统的TRIzol法，并且国产硅胶吸附柱法无论在miRNA提取的纯度还是浓度上均与进口硅胶吸附柱法不相上下，完全可替代进口硅胶吸附柱法。

[1]YAZBECK R，JAENISCH S E，WATSON D I.From blood to breath：new horizons for esophageal cancer biomarkers[J]. World J Gastroenterol，2016，22（46）：10077-10083.

[2]NEAGU M，ALBULESCU R，TANASE C.Biotechnology landscape in cancer drug discovery[J].Future Sci OA，2015，1（3）：FSO12.

[3]EHTESHAM N，SHARIFI M. From conventional therapy toward microRNA-based therapy in acute promyelocytic leukemia[J]. Adv Biomed Res，2016，5：187.

[4]SAPP R M，SHILL D D，ROTH S M，et al.Circulating microRNAs in acute and chronic exercise：more than mere biomarkers[J]. J Appl Physiol（1985），2017，122（3）：702-717.

[5]NUÑEZ-SÁNCHEZ M A，DÁVALOS A，GONZÁLEZ-SARRÍAS A，et al. MicroRNAs expression in normal and malignant colon tissues as biomarkers of colorectal cancer and in response to pomegranate extracts consumption：critical issues to discern between modulatory effects and potential artefacts[J]. Mol Nutr Food Res，2015，59（10）：1973-1986.

[6]LV W，MA W，YIN X，et al. Optimization of the original TRIzol-based technique improves the extraction of circulating microRNA from serum samples[J]. Clin Lab，2015，61 （12）： 1953-1960.