基于光诱导电子转移荧光传感器检测土壤中的Hg2+

刘 萍， 王书民， 任有良， 任梦萌

(1.商洛学院化学工程与现代材料学院，陕西商洛 726000；2.陕西省尾矿资源综合利用重点实验室，陕西商洛 726000)

汞是一种毒性很强的环境污染物，具有致畸作用，有生物不可降解性[1]。因此，建立一种简单、快速、选择性好、灵敏度高的检测Hg2+的方法非常重要。常用检测Hg2+的方法主要有原子吸收法[2]、电化学法[3]、 化学发光法[4]、荧光法[5 - 7]、高效液相色谱法[8]及电感耦合等离子体质谱法[9]等。胸腺嘧啶(T) 与 Hg2+能够特异性结合形成“T-Hg2+-T”结构，利用富含T碱基的短链 DNA 实现 Hg2+特异性检测的研究逐渐成为研究热点。如高强课题组[10]利用溴化乙锭为嵌入剂，设计了一种无需对DNA进行荧光标记的Hg2+荧光传感器。Ono等[11]利用分子信标的原理，设计了一种猝灭型的Hg2+荧光传感器。加入Hg2+后，T-Hg2+-T介导的发卡结构的形成，将相应荧光基团与猝灭基团拉近，二者之间发生荧光能量转移，导致荧光信号猝灭，从而实现Hg2+的检测。邓大庆等[12]利用Pb2+和Hg2+与凝血酶适配体作用引起其构型变化的不同，建立了分别检测Pb2+和Hg2+的荧光传感器。传统的荧光传感器荧光基团和猝灭基团大都是有机染料分子，有的还用纳米材料作为荧光猝灭剂。但是，基于纳米材料的检测方法往往实验步骤繁琐且耗时[13]。因此，寻找其他的猝灭剂，发展更简单且灵敏的荧光传感器是十分必要的。G碱基对荧光染料具有猝灭效应，常被用来构建荧光传感器[14 - 15]。

本研究基于光诱导电子转移(PET)效应，利用T与Hg2+形成“T-Hg2+-T”结构的特点，以末端标记羧基荧光素的凝血酶适配体为信号探针，末端上含三个G碱基互补序列作为猝灭基团，根据加入Hg2+前后体系荧光强度的变化，建立了一种简单、灵敏的荧光传感器用于土壤中Hg2+的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F-4600型荧光分光光度计(日本，日立公司)；Agilent 5100 ICP-OES(澳大利亚，安捷伦公司)；pHS-3B型pH计(上海精密科学仪器有限公司)；T-214型电子天平(北京丹佛仪器有限公司)；TGL-18C离心机(上海安亭科学仪器厂)。

羧基荧光素标记的凝血酶适配体(F-TBA)序列:5′-FAM-GGT TGG TGT GGT TGG-3′；cDNA1序列:3′-GGG CCA ACC ACA CCA ACC-5′；cDNA2序列:3′-GGG CCA ACC ACA CCA ACC-5′；cDNA3序列:3′-GGG CCA ACC ACA C-5′；cDNA4序列:3′-GGG CCA ACC AC-5′；cDNA5序列:3′-GGG CCA ACC-5′， 均购自上海生物工程有限公司,使用前均用10 mmol/L的Tris-HAc缓冲溶液(pH=7.4，含0.1 mmol/L NaCl、5.0 mmol/L MgCl2)配制成100 μmol/L DNA储备液，并于-20 ℃冷冻保存。其它化学试剂均为分析纯。所用溶液均用 Milli-Q水(18.2 MΩ·cm)配制。

1.2 实验方法

2 结果与讨论

2.1 方法原理及可行性分析

基于脱氧鸟苷G碱基的猝灭，本文设计了一种灵敏且简便的荧光传感器用于Hg2+的检测。无Hg2+时，F-TBA与cDNA杂交形成双链，cDNA末端富含的G碱基与荧光染料靠近，FAM和G碱基之间发生PET过程，FAM的荧光被G碱基猝灭。当Hg2+存在时，凝血酶适配体富含的T碱基与Hg2+特异性结合形成稳定的“T-Hg2+-T”结构，凝血酶适配体折叠形成类似双链的结构，释放出互补链，荧光染料远离G碱基，体系荧光强度增强。通过测定加入不同浓度Hg2+后体系荧光信号的变化，对环境土壤中的Hg2+进行定量分析。Hg2+测定的实验原理见图1。

图1 基于光诱导电子转移检测Hg2+的荧光传感器实验原理图Fig.1 Schematic illustration of Hg2+ detection based on the photoinduced electron transfer

为了验证该方案的可行性，实验分别对F-TBA、F-TBA/cDNA、F-TBA/cDNA+Hg2+的荧光光谱进行了扫描，结果如图2所示。图中曲线a表示F-TBA的荧光光谱，荧光强度较强，加入互补序列cDNA后，体系的荧光强度明显降低(曲线b)，说明两条DNA链已经杂交，FAM与G碱基间发生了高效的PET过程，荧光猝灭。加入不同浓度的Hg2+后，体系荧光强度增强，荧光恢复，且加入较大浓度Hg2+时，荧光恢复较多(曲线c和d)。表明加入Hg2+后形成T-Hg2+-T结构使F-TBA折叠成双链而远离cDNA，PET效率降低，荧光强度明显增强。

为了考察F-TBA/cDNA体系荧光信号的升高是由于Hg2+所致，实验考察了加入不同浓度Hg2+对F-TBA荧光信号的影响(图3)。结果Hg2+加入后F-TBA的荧光信号有所降低，且Hg2+的浓度越大，FAM荧光信号降低的程度越大。但在F-TBA/cDNA体系中加入Hg2+后荧光强度不但没有降低，反而增强。进一步表明该体系荧光增强原因可能是加入的Hg2+与T碱基特异性结合，TBA形成类似双链的“T-Hg2+-T”发夹结构，释放出互补链PET效率降低，荧光信号增强。

图2 F-TBA/cDNA体系与不同浓度Hg2+作用的荧光光谱图Fig.2 Fluorescence spectra of F-TBA/cDNA and Hg2+with different concentrations(a)5 μmol/L F-TBA;(b) a+10 μmol/L cDNA;(c)b+0.05 nmol/L Hg2+;(d) b+5 nmol/L Hg2+.

图3 F-TBA与不同浓度Hg2+作用的荧光光谱图Fig.3 Fluorescence spectra of F-TBA and Hg2+with different concentrations(a) 5 μmol/L F-TBA;(b-f ):a+0.01,0.1,1,10,100 nmol/L Hg2+.

2.2 实验条件的优化

图4 cDNA和F-TBA不同浓度比的荧光变化图Fig.4 Fluorescence variation of cDNA and F-TBA with different concentration ratio

2.2.1不同长度互补序列cDNA的选择考虑到不同碱基个数的互补序列与TBA杂交形成双链的稳定性对Hg2+检测有影响，实验选择了5个不同长度的cDNA,碱基互补数分别为15、12、10、8、6。结果显示，所有互补序列都能够有效猝灭FAM的荧光。当加入Hg2+后，碱基互补数为10的cDNA3荧光增强最多。原因可能是互补链越长，形成相对较稳定的双链结构，加入Hg2+后难以使双链解旋，加入Hg2+后适配体上FAM的荧光恢复较少。碱基数较少，形成的双链不稳定，加入Hg2+前背景荧光很高，加入Hg2+后适配体上FAM的荧光恢复也较少。选择cDNA3做互补序列比较合适。

2.2.2F-TBA与cDNA浓度比的选择F-TBA与cDNA的浓度比不同影响体系的背景信号，进而影响Hg2+的检测灵敏度。实验研究了不同浓度比的 F-TBA与cDNA体系加入 5 nmol/L Hg2+后体系荧光强度的变化。固定F-TBA 探针的浓度为 5 μmol/L，改变 cDNA的浓度，结果显示cDNA/F-TBA浓度比为1.5∶1时，荧光强度增强最大，见图4。

2.2.3稳定时间的选择考察了Hg2+加入F-TBA/cDNA体系充分作用的稳定时间。结果表明在反应初期，随着反应时间的增加，荧光强度不断增加，当反应到10 min时体系荧光强度最强，10 min后荧光强度稍有下降，且逐渐趋于平缓，故后续实验均选择混合10 min后测定。

2.3 检测范围和灵敏度

向F-TBA/cDNA体系中加入Hg2+前后，体系的荧光强度发生改变，通过荧光强度改变的量实现对Hg2+的定量检测。结果显示F-TBA/cDNA体系的荧光强度随Hg2+浓度的增大而升高(图5(A))，Hg2+的浓度在5.0×10-11～5.0×10-9mol/L范围内与体系荧光强度的变化值ΔF成良好的线性关系(图5(B))，线性方程为：ΔF=69.4c+196(c，nmol/L)，线性相关系数R=0.9985，方法的检出限达0.02 nmol/L。

图5 (A)加入不同浓度Hg2+后体系的荧光光谱图；(B)荧光强度变化率与不同浓度Hg2+的关系Fig.5 (A)Fluorescence spectra of the systems in the presence of different concentration of Hg2+(a:5 μmol/L F-TBA;b:a+7.5 μmol/L cDNA;Hg2+:c - k:0.05,0.25,0.5,2.5,5,50,500,1 000,2 000 nmol/L);(B) Relationship between the changes of fluorescence intensity and different concentration of Hg2+

2.4 共存离子的干扰实验

优化的条件下，考察了50 nmol/L Co2+、Mg2+、Zn2+、Na+、Al3+、Cd2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Cr3+、K+和 0.5 nmol/L Pb2+对Hg2+检测的影响。结果显示，加入Co2+、Mg2+、Zn2+、Na+、Al3+、Cd2+、Mn2+、Cu2+、Fe3+、Cr3+、K+后体系荧光信号变化值ΔF较低，基本上不影响Hg2+的响应，只有加入Hg2+和Pb2+时体系荧光响应值高，原因可能是F-TBA富含G碱基，Pb2+加入到F-TBA/cDNA体系会诱导F-TBA 形成稳定的G -四链体结构释放出互补链引起PET效率显著降低，荧光信号增强。加入柠檬酸做掩蔽剂后[16]，基本对Hg2+检测无明显干扰。表明本方法对Hg2+具有良好的选择性。

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2.5 土壤中Hg2+的测定

为了考察本方法的可行性，用设计的传感器检测了距离商海市商州区金尾矿库20米处农田土壤中的Hg2+。准确称取1.000 g土壤样品，加入15 mL浓HNO3、3 mL HClO4混合均匀后静置过夜，再加入2 mL 浓HCl，置于80 ℃烘箱中加热，当溶液蒸发至澄清的浅黄色并且微沸冒白烟时，冷却至室温，并用0.1%的HNO3洗涤过滤，最后用水定容至100 mL，然后将该溶液稀释100倍作为待测液，加入柠檬酸消除Pb2+的干扰。按实验方法进行测定并进行加标回收实验，结果见表1。实验结果与电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)相比较，两种方法所得结果基本一致。

表1 土壤样品中Hg2+的分析结果(n=3)Table 1 Determination results of Hg2+in the soils(n=3)

3 结论

本文基于鸟嘌呤G对荧光染料的猝灭作用，构建了一种荧光传感器，根据向F-TBA/cDNA体系中加入Hg2+前后，体系荧光信号的变化对土壤样品中Hg2+进行定性、定量分析。本方法只需对凝血酶适体进行单标记，无需引入其他有机染料或纳米材料做猝灭剂，减少了实验成本，加快了检测过程。传感器的建立对环境污染中的重金属检测有很好实际意义，具有广泛的应用前景。

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