气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定油脂类食品中氯丙醇酯

曹艳平*， 张 萍， 姜大峰

(山东省疾病预防控制中心，山东大学预防医学研究院，山东济南 250014)

氯丙醇是在食品加工过程中形成的污染物,其中3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)具有肾脏毒性、生殖毒性和较高的潜在致癌性。脂肪酸氯丙醇酯是氯丙醇上的羟基与脂肪酸结合态形式，在食用油和含油脂类食品中的污染水平较高。3-MCPD可与多种脂肪酸结合形成多种脂肪酸酯，根据羟基被取代的个数分为单酯和双酯，导致3-MCPD酯单体较多。二氯丙醇也可与多种脂肪酸结合形成多种脂肪酸单酯，有1,3-二氯丙醇(1,3-DCP)酯和2,3-二氯丙醇(2,3-DCP)酯。受到标准品的限制，一般是将氯丙醇酯水解后，间接测定其游离态3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP的含量，可分别体现其相应氯丙醇酯的总量。

氯丙醇酯的测定主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[1 - 4]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[5 - 7]。由于氯丙醇及其酯的沸点高，故基本上以检测衍生化产物为主。常用衍生剂主要有七氟丁酰基咪唑(HFBI)、三氟乙酐、对甲基苯磺酸的丙酮溶液等。样品中氯丙醇酯经碱或酸水解后，氯丙醇酯被水解为游离态的氯丙醇，水解液经酸或碱中和后进行衍生，衍生液进行GC-MS分析，以游离态的氯丙醇表示其对应的氯丙醇酯的含量。LC-MS可以直接测定各种单体的氯丙醇脂肪酸酯，定量取决于购买到的氯丙醇脂肪酸酯标准品的数目种类。

本文参考我国食品安全风险监测方法中氯丙醇酯测定前处理部分，测定方法采用气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)。建立的方法可测定4大类氯丙醇酯：3-MCPD酯、2-MCPD酯、1,3-DCP酯和2,3-DCP酯。由于二氯丙醇酯的标准品目前无法购买到，分别以其游离态1，3-二氯-2-丙醇、2，3-二氯-1-丙醇替代，其相应同位素内标同样以D5-1,3-二氯-2-丙醇和D5-2,3-二氯-1-丙醇替代。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

TSQ8000-1310GC气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(美国,Thermo Fisher公司)；460/H超声波清洗器(德国,Elma)；B-811自动索氏提取器(BÜCHI)；N-EVAP112氮吹仪(美国,Organmation Associates)；R-300旋转蒸发器(BÜCHI)；恒温干燥箱(50 L,MMM)。

标准品：3-MCPD棕榈酸二酯(98%)、2-MCPD硬脂酸二酯(98%)、氘代同位素内标D5-3-MCPD棕榈酸二酯(同位素纯度98.1%)和D5-2-MCPD硬脂酸二酯(同位素纯度98%)。双氯取代氯丙醇：1,3-二氯-2-丙醇(99%)；2,3-二氯-1-丙醇(97%)；D5-1,3-二氯-2-丙醇(同位素纯度98.9%)和D5-2,3-二氯-1-丙醇(同位素纯度98%)，均购自Toronto Research Chemicals Inc。甲醇、乙酸乙酯、无水乙醚、甲基叔丁基醚(色谱纯，Fisher Scientific公司);正己烷(色谱纯，Merck公司);无水Na2SO4(分析纯)：550 ℃ 烘烤4 h,待用;甲醇钠、冰乙酸(分析纯，上海国药集团)；七氟丁酰基咪唑(酰化剂，TCI公司)。 硅藻土基质分散固相萃取柱(2 000 mg/45mL)(配专用分散剂(3 g/袋)和高效脱水剂(15 g/袋)，福州勤鹏生物科技公司)。 甲醇钠溶液：称取2.70 g甲醇钠，加入50 mL甲醇，溶解后，装入塑料瓶冷藏，备用。混合液A：吸取80 mL甲基叔丁基醚和20 mL乙酸乙酯，充分混匀，于玻璃瓶中存放，冷藏，备用。混合液B：移取2.0 mL冰乙酸，加入25 mL饱和Na2SO4溶液混匀备用。分别准确称取适量(精确到0.01 mg)3-MCPD棕榈酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、1,3-二氯-2-丙醇、2,3-二氯-1-丙醇标准品，用乙酸乙酯-正己烷(1:1)溶解,定容,逐级稀释配制成4种氯丙醇酯混合标准使用溶液。其中1,3-DCP、2,3-DCP 浓度均为1.4 μg/mL，3-MCPD、2-MCPD浓度均为1.0 μg/mL；4种氘代内标也配制成混合内标使用溶液，其中D5-1,3-DCP与D5-2.3-DCP浓度均为2.0 μg/mL，D5-3-MCPD、D5-2-MCPD浓度均为1.5 μg/mL(均以其游离态3-MCPD、2-MCPD、D5-3-MCPD、D5-2-MCPD表示)。

1.2 样品中脂肪的提取

将样品粉碎后，按照国家标准[8 - 10]进行食品中脂肪的提取。油脂类样品可直接取样进行前处理。

1.3 样品的前处理

称取样品0.1 g(精确至0.001 g),加入0.5 mL混合液A,加混合内标使用液100 μL，用1.0 mL甲醇钠水解后，加入0.5 mL混合液B。将基质分散固相萃取柱配备的专用硅藻土填料倒入上述中和后的水解液中，使溶液分散、吸附于硅藻土中，将此混合物全部倒入硅藻土基质固相分散萃取柱中，用30 mL正己烷淋洗，弃去淋洗液。用80 mL重蒸无水乙醚洗脱，收集洗脱液，充分脱水后，洗脱液浓缩至约0.5 mL，用微量取样器加入50 μL七氟丁酰基咪唑，于温度75 ℃的电热恒温箱中放置30 min。衍生结束后，加入2 mL饱和Na2SO4溶液，补加异辛烷体积为1.0 mL，上清液脱水后，供GC-MS/MS测定。

1.4 分析条件

色谱条件：TG -5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，Thermo Fisher公司)；载气：高纯氦气，流量1.0 mL/min；柱温：50 ℃，保持1 min，以2 ℃/min升至90 ℃，再以40 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；进样口温度：250 ℃，不分流进样，进样量1.0 μL。

质谱条件：离子源(EI)温度：250 ℃，碰撞气：氩气，传输线温度280 ℃，溶剂延迟时间8 min，采用多反应模式(MRM)监测，通过优化得到每个氯丙醇衍生物的最佳的定量离子对、定性离子对及碰撞能量。相关参数见表1。

表1 各种氯丙醇衍生物的定性定量离子对参数Table 1 Parameters of MRM for chloropropaneol derivatives

通过仪器配制的工作站，分别以标准品中3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP 的质量(ng)对3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP 衍生物定量离子对峰面积与其相应同位素定量离子对峰面积的比值进行线性回归计算。

2 结果与讨论

2.1 脂肪提取

氯丙醇酯存在于脂肪中，油脂类样品可直接进行前处理，其它含油脂类食品需要先提取其脂溶性成分，将氯丙醇酯提取出来，提取脂肪的方法主要依据国家标准方法。

2.2 分析条件

图1 标准溶液中氯丙醇酯衍生物的MRM色谱图Fig.1 The MRM chromatograms of chloropropaneols derivatives in standard solution

氯丙醇衍生物是弱极性化合物，色谱柱采用弱极性的TG -5MS毛细管柱,升温程序采用二阶升温，选定条件下全部8种氯丙醇衍生物在16 min内出峰，分离良好。第二阶升温是为保护色谱柱，将样品测定液中的高沸点杂质赶出色谱柱。相关色谱图见图1。

根据子弹的弹道模型,利用Matlab软件编制子弹飞行弹道仿真程序,该程序在给出抛射点的母弹速度、抛射高度、抛撒时间、弹道倾角的条件下,应用四阶龙格库塔法可解得子弹弹道;进而通过画图程序生成落点分布、各枚子弹在三个坐标的变化以及分速度的变化坐标图。图2为计算子弹弹道仿真流程图。

2.3 分析方法的识别点数

本方法通过使用来自两个氯丙醇衍生物一级离子的二级质谱离子对，遵循了欧盟委员会指令(96/23/EC)[11]，并为每种化合物提供4个识别位点。

2.4 质谱分析条件的优化

三重四极杆质谱条件的优化主要包括母离子、子离子、碰撞能量等。分别使用5 μg/mL的标准溶液和其内标标准溶液，按照样品前处理程序水解、净化、浓缩、衍生后进行方法优化。选择最佳碰撞能量，每个化合物选择1个定量离子对，1个定性离子对。本方法采用多反应监测模式(MRM)，有效排除了复杂本底对检测结果的干扰。

2.5 标准曲线、检出限、回收实验与精密度

优化实验条件下绘制标准曲线，其线性方程、线性范围、相关系数(r)及检出限等见表2。使用未检出氯丙醇酯的油样做加标回收实验(n=6)，进行2个水平的加标回收实验，低、高二种浓度加标回收率均在在87.6%～106.4%之间，满足相关要求。

表2 各种氯丙醇衍生物的标准曲线及检出限Table 2 Parameters of calibration curves for chloropropaneol derivatives

*The detection limits corresponding to concentration giving signal to noise of 3 divided by sample weight(0.1 g).

2.6 净化效果

用硅藻土基质分散固相萃取柱净化样品，样品本底干扰少，连续测定100余份样品后，样品本底无升高，目标化合物保留时间没有漂移，检测器等整个系统灵敏度未下降，说明净化效果良好。

2.7 样品测定

采用本文方法对FAPAS样品T2642QC进行了测定，其3-MCPD酯赋值是0.579 mg/kg，测定值为0.597 mg/kg。对山东省2015年部分油脂类食品植物油、奶粉、方便面、油条、麻花、馓子进行了分析测定，部分食品中检出了3-MCPD酯和2-MCPD酯，3-MCPD酯最高值是9.34 mg/kg，2-MCPD酯最高值是6.79 mg/kg，没有检出1,3-DCP酯和2,3-DCP酯。

3 结论

采用气相色谱-三重四极杆串联质谱，以多反应监测模式测定氯丙醇酯，降低了复杂本底对检测的干扰，提高了检测灵敏度，同位素内标法定量准确，硅藻土基质分散固相萃取柱净化效果好。

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[10] GB/T 5413.3-2010.Determination of Fat in Foods for Infantsr and Yound Children Milk and Milk products(婴幼儿食品和乳品中脂肪的测定).

[11] European Commission Decision,2002/657/EC,Implementing Council Directive96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results,Offic J Eur Commun.L221(2002)8.