石墨烯/纳米二氧化钛/月桂酰-羧甲基壳聚糖电化学传感器对奶粉中痕量锌的测定

谭福能，李蕾

（文山学院化学与工程学院，云南文山663000）

锌是人体所必需的微量元素之一，同时也是人体内多种酶的重要成分，在人体生长发育过程中具有重要作用，能够维持正常食欲、增强免疫力、促进伤口愈合、维持男性的生精功能、清除体内胆固醇[1-4]。缺锌时会导致食欲下降、生长发育缓慢，免疫力低下，同时易患上味觉障碍、口腔溃疡、痤疮、男性前列腺炎等疾病，但体内锌含量过高也会带来危害，甚至出现顽固性贫血，食欲下降，合并有血清脂肪酸及淀粉酶增高等症状[5-6]。因此对锌含量的测定具有重要意义。目前测定锌含量的方法主要有原子吸收光谱法[7]、极谱分析法[8]、分光光度法[9]、荧光法[10]等，但都存在一些缺点，如原子吸收光谱法样品预处理复杂：极谱吸附法所用滴汞电极残余电流较大，导致灵敏度不高，同时电极中汞易挥发且有毒：分光光度法测定准确度不高：荧光法易受其他离子的干扰，荧光会湮灭。而通过电化学传感器检测锌具有成本低，前处理简单，灵敏度和准确度较高的优点。

石墨烯（graphene，GR）具有良好的导电性和大的比表面积，作为新型化学修饰电极的材料，具有良好的的吸附性能，能显著提升电化学传感器的灵敏度，降低检出限[11-12]。但石墨烯不溶于任何溶剂，只能够分散在溶剂中形成悬浮液，这也限制了石墨烯作为化学修饰电极材料方面的应用。

纳米TiO2由于其大的比表面积、良好的化学稳定性、表面活性、生物活性、和电催化活性等优点而被用做化学修饰电极材料[13]。同时，纳米TiO2兼具了纳米材料和金属氧化物的优点，对金属离子有较好的富集作用[14]。

壳聚糖（chitosan，CS）是甲壳素脱N-乙酰基的产物，是自然界中储量丰富的天然高分子多糖，但壳聚糖水溶性较差，通过化学改性，可得到具有两亲性的壳聚糖衍生物[15]，使其兼具了天然高分子的生物活性、生物相容性和表面活性剂的表面活性、乳化性、增溶性[16]。

本文将壳聚糖改性为月桂酰-羧甲基壳聚糖（lauryl-carboxymethyl chitosan，LA-CMCS），并与石墨烯、纳米二氧化钛制成复合膜修饰玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE），制备了石墨烯/纳米二氧化钛/月桂酰-羧甲基壳聚糖电化学传感器（GR/TiO2/LA-CMCS/GCE），通过两亲性的月桂酰-羧甲基壳聚糖的来分散石墨烯和纳米TiO2，从而改善石墨烯和纳米TiO2因分子间范德华力在水中易聚集、分散性较差的缺点，使二者的电化学特性得到充分的发挥，将该传感器用于对奶粉中痕量锌的测定。

图1LA-CMCS的合成路线Fig.1 Synthetic route of LA-CMCS

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CHI760E电化学工作站：上海辰华仪器有限公司；玻碳电极（GC，Φ=3 mm）：北京仪电科技有限公司；铂电极（辅助电极）、饱和甘汞电极（参比电极）：上海雷磁仪器厂；IRPrestige-21型傅立叶变换红外光谱仪：日本岛津公司；壳聚糖（脱乙酰度为95%）：国药集团上海试剂厂；石墨烯：苏州碳丰石墨烯科技有限公司；纳米TiO2：上海迈坤化工有限公司；月桂酰氯（分析纯）：上海罗恩试剂有限公司；氯乙酸：南京化学试剂有限公司；锌标准溶液（0.1 mol/L，使用时稀释到所需浓度）：天津致远化学试剂有限公司。

1.2 月桂酰-羧甲基壳聚糖的制备

取2 g壳聚糖，加入20 mL氢氧化钠溶液（30%），不断搅拌3 h，使其碱化充分，然后不断搅拌条件下加入40 mL异丙醇，缓慢滴加溶有1.5 g氯乙酸的乙醇溶液5 mL，45℃下搅拌回流反应5 h，分别用无水乙醇、丙酮洗涤3次后抽滤，放入真空干燥箱中50℃下干燥10 h后取出研碎，得到羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）。

取1 g羧甲基壳聚糖，加入90 mL异丙醇，再加入1 g NaOH，不断搅拌使其溶解充分，，然后滴加4 g月桂酰氯，50℃下回流反应5 h，分别用无水乙醇、丙酮洗涤产品，抽滤后产品放入干燥箱中50℃下真空干燥后取出研碎，得到月桂酰-羧甲基壳聚糖。合成路线如图1。

1.3 石墨烯/纳米二氧化钛/月桂酰-羧甲基壳聚糖修饰电极的制备

用A12O3（0.05 μm，0.03 μm）粉将玻碳电极抛光至镜面后用蒸馏水洗净，然后将电极置于超声清洗仪中，分别用乙醇和蒸馏水超声清洗3 min，再置于0.5 mol/L的H2SO4溶液中，循环扫描（扫描范围为-1.5 V～1.5 V，扫描速度为100 mV/s）至循环伏安曲线稳定为止。

取2gLA-CMCS溶解于50mL蒸馏水中，将活化处理好的玻碳电极置于LA-CMCS溶液中，循环扫描50圈（扫描范围为-1.5 V～1.5 V，扫描速度为100 mV/s），取出电极后用蒸馏水淋洗3次，氮气吹干后备用。

称取0.1 gGR、0.05 g纳米TiO2和0.1 gLA-CMCS，置于100 mL蒸馏水中，不断搅拌30 min后置于超声清洗仪中，超声震荡30 min使其分散均匀，得到混合悬浮溶液，使用微量进样器吸取悬混液4 μL滴涂到上述制好的电极上，红外灯下烘干后备用。修饰电极制备过程线路如图2。

图2GR/TiO2/LA-CMCS/GCE的制备过程Fig.2 Preparation process of GR/TiO2/LA-CMCS/GCE

1.4 月桂酰-羧甲基壳聚糖的傅立叶变换红外分析

取适量干燥的LA-CMCS，研磨成粉末状后与KBr混合压片，样品用IRPrestige-21型傅立叶变换红外光谱仪进行红外扫描，扫描范围为4 000 cm-1～400 cm-1。

1.5 交流阻抗测试

交流阻抗测试（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）的工作电极分别为GCE、GR/TiO2/LACMCS/GCE，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极。电解质为50 mL乙酸-乙酸钠（pH4.2）的溶液和5 mL 0.01 mol/L的铁氰化钾的混合液，交流微扰幅度10 mV，扫描频率为100 kHz～10 mHz。

1.6 循环伏安测试

循环伏安测试（cyclic voltammetry，CV）的工作电极、参比电极、辅助电极与EIS测试一致。电解质为Zn2+溶液和乙酸-乙酸钠（pH4.2）混合液，扫描速率为100 mV/s，扫描范围为-0.1V～0.6 V。

1.7 线性伏安测试

线性伏安实验（linear sweep voltammetry，LSV）以不同浓度Zn2+溶液和乙酸-乙酸钠（pH4.2）混合液作为电解质溶液。采用上述方法的三电极系统进行测试，在恒电压下富集80 s，静置10 s后进行扫描。扫描范围-1.7 V～0.3 V，扫描速率为100 mV/s。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

图3为壳聚糖，羧甲基壳聚糖，月桂酰-羧甲基壳聚糖的红外光谱图。

图 3CS、CMCS、LA-CMCS 的红外光谱图Fig.3IR of CS，CMCS and LA-CMCS

由图3可见，在b、c谱线中，1 610 cm-1～1 618 cm-1处为-COOH的伸缩振动吸收峰，这表明羧甲基已成功引入到壳聚糖上，b谱线中1 050 cm-1～1 150 cm-1处CO-C键的不对称伸缩振动吸收峰明显增强，1 615 cm-1处吸收峰为羧基钠盐的特征吸收峰，表明-COOH已经接到了-OH位上；c谱线中2 960 cm-1～2 870 cm-1处吸收峰是-CH3和-CH2-的伸缩振动吸收峰，说明月桂酰基已接到壳聚糖上。

2.2 交流阻抗表征

以1 mmol/L的铁氰化钾溶液为电化学探针，进行不同电极的交流阻抗试验，结果见图4。

由图4可见，GCE的阻抗图在高频区一条曲线，半圆状不明显，低频区则呈直线，说明在玻碳电极上电荷表面传递电阻Rct的值较小，电子传递速度很快，而在GR/TiO2/GCE和GR/TiO2/LA-CMCS/GCE的EIS图谱上，高频区明显呈现半圆状、低频区则呈直线，说明纳米TiO2、石墨烯、LA-CMCS已成功修饰到电极上，其阻碍了电子的传递，使得修饰电极表面的Rct增大，且电极过程是受动力学和扩散联合控制[17]。而GR/TiO2/LA-CMCS/GCE图谱上的半圆更小，说明此电极表面的Rct要小于GR/TiO2/GCE，这是由于LA-CMCS更好地分散了石墨烯，使修饰膜层传递电子速度变快。

图4 不同电极上铁氰化钾的交流阻抗谱图Fig.4 EIS of potassium ferricyanide at different electrodes

2.3 锌离子的电化学行为

分 别 以 GCE、GR/TiO2/GCE、GR/TiO2/LA-CMCS/GCE为工作电极在10 μmol/L锌离子溶液中进行循环伏安扫描，结果见图5。

图5 不同电极上锌离子的循环伏安曲线Fig.5 CV of zinc（II）at different electrodes

由图5可知，在3种电极上的循环伏安行为均在-1.0 V附近出现一峰形好、峰电流较大的峰，但GR/TiO2/LA-CMCS/GCE和GR/TiO2/GCE上的峰电流明显要大于玻碳电极，这说明电极通过修饰后对锌离子的检测具有更高的灵敏度，这是由于石墨烯和纳米TiO2对锌离子均有较强的吸附和富集作用，能增强电极对锌离子的电催化作用。而相对GR/TiO2/GCE，GR/TiO2/LA-CMCS/GCE上的峰电流更大，这是由于LA-CMCS较好地分散了石墨烯和纳米TiO2，使修饰电极的复合膜富集和导电能力更强，同时LA-CMCS上的-NH2能与锌离子形成配合物吸附在电极表面，有利于氧化还原反应的进行

2.4 电解质底液和pH值对测试峰电流的影响

电解质底液对修饰电极的电催化作用有重要影响，分别选择了0.1 mol/L KCl、HAc-NaAc、NaH2PO4-Na2HPO4、KNO3加入到蒸馏水中作为电解质底液，pH值在6.8～7.2之间，以GR/TiO2/LA-CMCS/GCE为工作电极，研究了电解质底液对锌离子溶出峰的影响（见图 6）。

图6 锌离子在不同底液中的循环伏安曲线Fig.6 CV of zinc（II）at different electrodes

图6结果表明，锌离子在HAc-NaAc中峰电流最大，背景电流较小，峰形最好，峰电位较小，故选用HAc-NaAc作为底液。

循环伏安法考查了在不同pH值（2.6～5.8）条件下锌离子在HAc-NaAc底液中溶出峰峰电流的变化情况，结果见图7。

图7 不同pH值下锌离子的峰电流Fig.7 Peak current of zinc（II）at different pH

从图7可以看出，随着pH的增加，锌离子的峰电流先增大后减小，这是因为CS的等电点为6.3，在pH值为4.2时带正电荷，此时LA-CMCS上部分氨基和羧基被质子化而带正电，这就使得修饰复合膜层带正电而加速了电子的传递，峰电流增大。故实验选择pH4.2的HAc-NaAc溶液电解质底液。

2.5 扫描速度的影响

以GR/TiO2/LA-CMCS/GCE为工作电极，在不同扫描速度下进行CV实验（见图8）。

图8 扫描速度对锌离子峰电流的影响Fig.8 The effect of scan rate on the peak current of zinc（II）

由图8可知随着扫描速度的增大，峰电流增大。峰电流与扫描速度呈线性关系（图8插图），线性方程为Ipa（μA）=-1.31-0.052 v（mV/s），r=0.999 19，表明该电极反应过程主要受吸附控制。锌离子在-1.0 V修饰电极富集后还原为锌，当电位向正方向扫描时，锌又被氧化成锌离子，当扫描速度增加时，CV曲线的背景电流也变大，影响了锌离子的检测，为使修饰电极能兼顾高灵敏度和低背景电流，故选择扫描速度为100 mv/s。

2.6 富集电位及富集时间的选择[l2]

改变富集电位从-1.5 V～-0.5 V，结果表明，随着富集电位正移，锌的溶出峰电流先增大后减小，富集电位为-1.1 V时，溶出峰电流值最大。改变富集时间在40 s～120 s范围内，峰电流值随着富集时间的延长，溶出峰电流增大。当富集到一定时间超过100 s后峰电流变化不再明显，这说明电极与电解质溶液界面之间达到富集平衡，锌离子吸附量已饱和。因此本试验选择富集电位-1.1 V，时间为100 s。

2.7 对锌离子的测定

按上述试验方法对不同浓度锌溶液进行测定（图 9）。

图9 不同浓度下锌离子的LSV曲线Fig.9 LSV of zinc（II）at different concentrations

图9结果表明，该电化学传感器传感器在-1.1 v时，锌离子的峰电流与其浓度在2.0×10-8mol/L～4.0×10-4mol/L的范围内成线性关系（见图9插图），线性方程为 I（μA）=-1.189+0.467 9c（μmol/L），相关系数 R为0.998 3，以3倍的标准偏差法计算得检出限为1.3×10-8mol/L。对2.0×10-5mol/L的锌离子溶液平行测定10次，相对标准偏差为2.1%，将GR/TiO2/LA-CMCS/GCE室温下放置5 d，测定时锌离子峰电流减小了5.1%，和放置前变化不大，说明此传感器稳定性和重现性较好。

2.8 样品分析

按上述试验方法对5种婴幼儿奶粉样品中锌的含量进行了测定，每个样品测定5次，与火焰原子吸收分光光度法（AAS）测定的结果进行比较，AAS测定锌时按照GB 5413.21-2010《婴幼儿食品和乳品中钙、铁、锌、钠、钾、镁、铜和锰的测定》中的要求进行，结果见表1。

表1 奶粉样品锌含量分析Table 1 Determination results of zinc（II）in milk powder

由表1结果可知，通过GR/TiO2/LA-CMCS/GCE电化学传感器的结果和AAS测定结果大致相同，每个样品测定5次，经标准曲线法计算，RSD为在3.1%～4.1%之间，回收率为在97.4%～103.2%之间，说明该电化学传感器具有良好的稳定性。

3 结论

本文用两亲性月桂酰-羧甲基壳聚糖与石墨烯、纳米TiO2制成复合膜修饰玻碳电极（GCE），制备了能检测痕量锌的电化学传感器。结果表明：经过化学修饰后电极对锌离子具有良好的吸附富集作用，电化学灵敏度变大。交流阻抗试验表明GR/TiO2/LA-CMCS复合膜已经成功修饰到电极表面。将该电化学传感器成功用于对婴幼儿奶粉锌含量的测定，检出限为检出限为1.3×10-8mol/L，相对标准偏差为2.1%。此传感器制备简便，重现性和稳定性较好，线性范围宽，为痕量锌的检测提供了一种新方法。

参考文献：

[1]THIAGO C O,JHONYS M F,RODRIGO A A,et al.A batch injection analysis system with square-wave voltammetric detection for fast and simultaneous determination of naphazoline and zinc[J].Talanta,2016,152(15):308-313

[2]CAMARA F,MORENO R.Zinc:Properties and Determination[J].Encyclopedia of Food and Health,2016,132:638-644

[3]ARTUR K,WOLFGANG M.The biological inorganic chemistry of zinc ions[J].Archives of Biochemistry and Biophysics,2016,611(12):3-19

[4]POMASTOWSKI P,SPRYNSKYY M,BUSZEWSKI B.The study of zinc ions binding to casein[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2014,120:21-27

[5]KYUNG H K,TOMOYUKI U,YOSHIO A,et al.Determination of effective growth time for zinc oxide nanorods using chemical solution deposition[J].Superlattices and Microstructures,2015,88(11):150-153

[6]GAO L Y,SHANG H Z,CHANG L,et al.Determination and analysis on nutritional components inplacenta of plateauyak[J].Anim Husb Feed Sci,2009,1(2):15-17

[7]何绍攀,范广宇,蒋小明,等.钨丝电热原子吸收光谱分析法测定痕量锌[J].分析化学,2010,38(5):707-710

[8]梁信源,蔡卓,黎铉海.极谱法测定锌、锑渣氧粉中的铟[J].光谱实验室,2012,29(3):1311-1314

[9]赵书林,夏心泉,赵秀玲.同时测定人发中铜、铁、锌的分光光度法研究[J].环境化学,2015(6):560-563

[10]包楚才,刘付建,刘琼,等.波长色散X射线荧光光谱法快速测定内外墙涂料中的钛、钙、钡、锌、镁和硅[J].理化检验:化学分册,2016,52(10):1178-1180

[11]SAIBOM P,SIYAO H,JIANENG W,et al.Graphene-polyethylene nanocomposites:Effect of graphene functionalization[J].Polymer,2016,104:1-9

[12]CLOCHARD M C,MELILLI G,RIZZA G,et al.Large area fabrication of self-standing nanoporous graphene-on-PMMA substrate[J].Materials Letters,2016,184(12):47-51

[13]MUSTAFA A,NASHED G,NASSER I M.TiO2doped with SnO2and studing its structurail and electrical properties[J].Energy Procedia,2011,6:11-20

[14]MEHUL B,SACHIN Y,AKASH U B.Synthesis and characterization of TiO2thin films for DSSC prototype[J].Materials Today:Proceedings,2016,3(6):2052-2061

[15]MUXIKA A,ETXABIDE A,URANGA J,et al.Chitosan as a bioactive polymer:Processing,properties and applications[J].International Journal of Biological Macromolecules,2017,105(2):1358-1368

[16]PATRULEA V,OSTAFE V,BORCHARD G,et al.Chitosan as a starting material for wound healing applications[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,2015,97:417-426

[17]ZHOU C,ZHENG Y,LI Z,et al.Preparation and electrochemical properties of functionalized ionic liquid self-assembled modified graphite electrode[J].Electrochimica Acta,2009,54(24):5909-5913