猪丁型冠状病毒与猪流行性腹泻病毒双重实时荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

罗尚星，范京惠*，刘宝京，师乾凯，侯林杉，左玉柱,2*

(1. 河北农业大学动物医学院，保定 071001；2. 河北农业大学动物科技学院，保定 071001)

猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)属冠状病毒属，是一种以腹泻、脱水为临床症状的猪肠道传染病，各年龄段的猪均易感，其中新生仔猪最易发病[1]。本病于2012年首次于我国香港发现，2014年于美国大面积暴发，后在韩国、加拿大均检出此病毒[2-4]。国内一些学者研究发现PDCoV的感染率为20%～30%，个别地区高达40%[5-7]，使猪场腹泻形势更加严峻。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是目前我国引起仔猪腹泻的主要病原，自1976年传至我国以来，给养猪业造成了严重的效益损失，2010年由于PEDV流行毒株的变异，导致中国南方十余个省份上亿头仔猪死亡[8-9]。由于感染PDCoV的动物临床症状与感染PEDV的动物临床症状相似，且PDCoV常与PDEV等发生混合感染，导致确诊困难，因此，建立一种快速、准确而又灵敏的检测手段对于仔猪腹泻病的确诊、监控及分子流行病学调查等均具有重要意义。

目前用于PDCoV和PEDV检测RT-PCR方法较多，有单一RT-PCR也有多联RT-PCR的方法，但无论PDCoV还是PEDV，一旦发病，肠道内的病原数量不稳定，常规RT-PCR有可能由于敏感性低出现较高的假阴性较多，并且不能进行准确的定量，且由于后续需要电泳才能观察结果，存在安全问题；荧光定量RT-PCR检测方法因具有快速，简便，安全，灵敏度高，且可定量等优点，是一种更适用于临床检测的检测方法。

本研究根据PDCoV和PEDV的保守基因序列设计了两对特异性引物，分别扩增其保守区基因并将其克隆至pMD19-T载体，以梯度稀释的混合重组质粒为标准品，利用SYBR Green I染料的非特异性与PDCoV和PEDV的cDNA分别进行结合，并利用RT-PCR中扩增片段的Tm值的不同进行核酸片段的区分，构建了检测PDCoV和PEDV的双重荧光定量RT-PCR方法。为仔猪腹泻病的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒

猪丁型冠状病毒(PDCoV)HB-BD株(N基因GenBank登陆号KY129986)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)HB/HS株(M基因登录号：JF690779)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪博卡病毒(PBoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)均由河北农业大学动物医学院动物传染病实验室分离并保存。

1.2 临床样品

2016—2017年在河北省保定市、石家庄市、邯郸市以及张家口市等地区，发生腹泻病新生仔猪的肠道内容物130份，-80 ℃保存备用。

1.3 主要试剂

RNA提取试剂盒和Top Green qPCR Super Mix 为TransStart 公司产品；反转录试剂盒、DL2000 DNA Marker 、pMD19-T 载体等为TaKaRa 公司产品；罗氏96型荧光定量 PCR仪为罗氏诊断产品(上海)有限公司产品；Nanodrop 2000为美国Thermo Scientific 公司产品。

1.4 引物的设计

根据GenBank中登陆的PDCoV基因序列设计了一对特异性引物，对PDCoV的N基因保守序列进行扩增。上游引物NF1：5′-TACTGGTGCCAATGTCGGCTCTG-3′，下游引物NR1：5′- AGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCAT -3′ 由三博远志公司合成。根据 GenBank 登录的 PEDV的M基因序列，设计荧光定量 RT-PCR 引物，PEDVF1：5′-GGTGGTCTTTCAATCCTG-3′，PEDVF2：5′-GCAACCTTATAGCCCTCT-3′。引物由三博远志公司合成。

1.5 病毒cDNA的获取

按照RNA提取试剂盒说明书进行病毒核酸的提取，将提取的核酸产物通过反转录试剂盒进行反转录，获得cDNA。

1.6 荧光定量RT-PCR方法的建立

1.6.1 标准品的制备 将PDCoV和PEDV的 cDNA分别使用特异性引物进行PCR扩增，扩增体系含有模板cDNA 4 μL，dNTP 3 μL，10×Buffer (2.5 μmol·L-1)2.5 μL，上、下游引物(20 μmol·L-1)各1 μL，Taq酶(5 U·μL-1) 0.5 μL。PDCoV的反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PEDV反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 延伸5 min。将扩增的目的基因片段与载体pMD19-T连接并转化至大肠杆菌DH5α。重组质粒经PCR鉴定并送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果与GenBank 序列比对无误后，通过Nanodrop 2000测定质粒的OD值，用公式转换成拷贝数，作为标准品。

1.6.2 单一荧光定量RT-PCR的反应 将制备的标准品分别进行10倍梯度稀释后进行PCR扩增。每个梯度做三个重复，对扩增结果进行分析，建立各自的标准曲线。同时对其熔解曲线进行分析，以排除引物二聚体及非特异性扩增的干扰。反应体系为SYBR Green I Mix 7.5 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL，上下游引物各(20 μmol·L-1)0.6 μL，模板1.5 μL，去离子水4.6 μL。PDCoV的反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环；PEDV的反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环。同时设置无菌水为阴性对照。

1.6.3 多重荧光定量RT-PCR的反应 对多重荧光定量RT-PCR的反应温度，反应体系进行优化，确定反应条件。以梯度稀释的标准品为模板，反应体系为SYBR Green I Mix 7.5 μL，ROX Ⅱ 0.2 μL，PDCoV上下游引物(20 μmol·L-1)各0.2 μL，PEDV上下游引物(20 μmol·L-1)各0.6 μL，PEDV模板1.2 μL，PDCoV模板0.4 μL，去离子水4.4 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35个循环。同时设置无菌水为阴性对照。

1.6.4 敏感度试验 用有限稀释法对标准品进行稀释，用已经建立的反应条件进行定量检测，确定其敏感度。

1.6.5 特异性试验 提取病毒PCV2、PRV、PBoV、TGEV的核酸(其中TGEV的RNA提取后，经反转录得到cDNA)，按本试验所建立的检测方法进行扩增，同时设置无菌水作为阴性对照，PDCoV和PEDV的混合重组质粒阳性对照，检测该方法的特异性。

1.6.6 重复性试验 将同一批不同稀释度的标准品按建立的方法重复3次进行组内重复试验，对3次不同时间段稀释的同一浓度的标准品进行组间重复试验，对试验结果进行统计，分析此方法的重复性。同时设置无菌水为阴性对照。

1.7 临床样品的检测

对收集的130份临床样品进行检测，以本实验室建立的PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法与普通RT-PCR检测方法进行同步检测，以掌握河北省腹泻病猪中PDCoV和PEDV的感染情况。

2 结 果

2.1 标准品的制备

用设计的特异性引物对提取的核酸进行特异性扩增，得到PDCoV(262 bp)和PEDV(145 bp)的预期大小基因片段。将PDCoV (262 bp)的片段与PEDV(145 bp)的片段分别克隆至pMD19-T载体后，经序列测定分析，与GenBank相应序列完全一致。重组质粒经Nanodrop 2000测定，PDCoV质粒的浓度为165 μg·mL-1，通过公式换算得到重组质粒的拷贝数为5.1×1010拷贝·μL-1，PEDV质粒的浓度为100 μg·mL-1，通过公式换算得到重组质粒的拷贝数为3.2×1010拷贝·μL-1。图1为重组质粒PCR鉴定图。

2.2 标准曲线的建立

将制备的标准品10倍梯度稀释后进行荧光定量RT-PCR扩增，通过系统自动分析软件分析，可以得到以拷贝数的对数为纵坐标，Ct值为横坐标绘制荧光定量RT-PCR的标准曲线(图2)。由图2可知，在101～108拷贝·μL-1的范围内，构建的2个标准品的标准曲线均呈现良好的线性关系，扩增效率均大于90%，相关系数R2均在0.99以上。标准曲线比较理想。

M. DL2000相对分子质量标准；1. PDCoV N基因条带；2. PEDV M基因条带M. DL2000 marker; 1. PDCoV N gene stripe; 2. PEDV M gene stripe图1 重组质粒PCR鉴定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

2.3 熔解曲线的分析

标准品各个稀释度的熔解曲线有且仅有一个峰值，没有杂峰出现，其中PEDVM基因的熔解温度约为85 ℃，PDCoVN基因的熔解温度约为87 ℃(如图3A所示)。双重荧光定量熔解曲线图如图3B所示，熔解曲线有两个特异性峰值，分别为85和87 ℃，阴性对照没有峰值。

2.4 灵敏度分析

将标准品进行10倍梯度稀释，按照所建立的条件，进行荧光定量RT-PCR扩增。结果表明，双重的荧光定量RT-PCR最低可以检出含51拷贝·μL-1的PDCoV的样品，含32拷贝·μL-1的PEDV的样品。

2.5 特异性分析

利用建立的荧光定量RT-PCR方法对PBoV、TGEV、PCV2和PRV进行特异性检测，并选取PDCoV和PEDV的混合重组质粒以作为阳性对照，以去离子水作阴性对照，结果如图4所示，除阳性对照外，其他病毒与阴性对照均没有出现特异性扩增曲线，表明该检测方法的特异性较好。

2.6 重复性分析

为验证所建立的检测方法的重复性，对同一批稀释的标准品按建立的方法重复3次进行组内重复试验，并对3次不同时间稀释的同一浓度的标准品进行组间重复试验，结果显示，组内检测的变异系数为0.327%～1.901%，组间检测的变异系数为0.622%～2.858%，表明该方法具有较高的可重复性。

图2 荧光定量标准曲线Fig.2 Fluorometric standard graph

A. 标准品的熔解曲线；B. 双重荧光定量熔解曲线A. The melting curve of the standard product; B. Two fluorescence quantitative melting curves图3 熔解曲线的分析Fig.3 Analysis of the melting curve

1.PDCoV和PEDV的混合重组质粒;2～6. PBoV、TGEV、PCV2、PRV和水1.PDCoV and PEDV recombinant plasmid; 2-6. PBoV, TGEV, PCV2, PRV, and water图4 特异性检测Fig.4 Specificity detection

2.7 临床样品的检测

用本试验所建立的PDCoV和PEDV的双重荧光定量RT-PCR检测方法，与普通RT-PCR检测方法分别对来自河北省不同地区的130份临床样本进行检测。检测结果显示，普通RT-PCR检测方法检出率较双重荧光定量RT-PCR检测方法检出率低，双重荧光定量RT-PCR检测方法PDCoV的检出率为16.9%(22/130)，PEDV的检出率为66.2%(86/130)，二者同时感染的检出率为2.3%(3/130)，普通RT-PCR检测方法的PDCoV检出率为11.5%(15/130)，PEDV的检出率为60.8%(79/130)，二者同时感染的检出率为0.8%(1/130)，结果提示这两年引起仔猪腹泻的主要病原仍为猪流行性腹泻病毒。

3 讨 论

PDCoV又称δ冠状病毒，是继α冠状病毒属的PEDV和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)之后，发现的又一能引起猪腹泻的冠状病毒，可引起各个年龄段猪的呕吐和腹泻，以及哺乳仔猪的脱水和死亡[10]。猪流行性腹泻是由PEDV引起仔猪腹泻、呕吐的一种高致死性的肠道传染病[11]。两者发病率均较高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失，目前二者并没有有效的药物进行防治，且在发病症状，病理变化上均无明显差异，又易发生混合感染，因此，建立一种快速、准确而又灵敏的检测手段，对PDCoV和PEDV进行多重检测，是非常有必要的。

近年来，多重RT-PCR的诊断方法已被很多学者用于病原混合感染的鉴别诊断。传统的检测方法(如细胞分离培养、酶联免疫吸附试验等)虽能对病原鉴别诊断，但其具有耗时长、检测灵敏度低的缺点。而多重荧光定量RT-PCR技术是目前鉴别诊断二者的最为快速、灵敏的方法。胡慧等建立了PDCoV和TGEV的多重RT-PCR检测引物及检测方法，其对PDCoV和TGEV的最低检测量分别为40.5和547拷贝·μL-1 [12]；任玉鹏等建立一种同时检测PEDV、TGEV、PDCoV的多重RT-PCR方法，其最低检测量分别为60.96、102.69和58.85 pg[13]；陈小芬建立了一种检测PEDV、TGEV和PDCoV三重RT-PCR检测方法，检出PEDV、TGEV、PDCoV的最低含量分别为33.4、28.56、322.3 pg[14]。本研究建立了一种检测PDCoV和PEDV 的双重SYBR Green I荧光定量PCR方法，与以上学者的结果相比，结果更为灵敏，敏感度更好一些。

SYBR Green I染料是一种非特异性染料，可以与DNA小沟进行结合，但其在多重PCR反应中并非均一结合，而会与某些片段优先结合[15]，这就需要对其反应体系进行优化，本试验就对反应体系进行了优化，并最终确定了PDCoV和PEDV之间的比例。特异性试验结果显示，本试验建立的PDCoV和PEDV的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，能特异的扩增PDCoV和PEDV的靶基因片段，并利用熔解曲线的特异性峰值进行区分，而PBoV、TGEV、PCV2、PRV及去离子水均未见特异的扩增曲线，提示该方法具有良好的特异性。对2016年至2017年在河北省不同地区收集的130份临床样本进行PDCoV检测，结果显示，PDCoV的检出率为16.9%，PEDV的检出率为66.2%，二者同时感染的检出率为2.3%，提示这两年引起仔猪腹泻的主要病原仍为PEDV，但河北省猪群中存在PDCoV的感染，应加强该病的防控。

4 结 论

建立了一种快速检测猪丁型冠状病毒(PDCoV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法，其对PDCoV和PEDV的最低检测量分别为51和32拷贝·μL-1，与PBoV、TGEV、PRV、PCV2无交叉反应，特异性较好。用其检测130份仔猪腹泻样本，PDCoV检出率为16.9%，PEDV检出率为66.2%，二者同时感染的检出率为2.3%。为PDCoV和PEDV的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。

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2.2.3 教练员对运动员文化学习的监管情况 教练员与文化课老师就运动员的文化学习进行沟通、交流的情况，在一定程度上也会左右运动员的学习态度。调查发现，绝大多数教练员勤于与文化课老师进行沟通，这对于运动员的学习将会起到良好的监管和督促作用。只有个别教练员表示与文化课老师交流情况“一般”。显然，这不利于帮助运动员端正学习态度。这可能是由于教练员自身训练和比赛的压力较大，缺少时间，交通不便等，从而与文化课教师疏于沟通和配合。

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