R848联合Poly(I:C)促进DC抗原呈递和增强T细胞杀伤效果的研究*

黄 雪, 王 策, 陈 尚, 杨晓菲， 郑媛媛, 王京波, 李富荣

(暨南大学第二临床医学院， 深圳市人民医院, 转化医学协同创新中心, 深圳市免疫细胞治疗公共服务平台， 广东 深圳 510020)

恶性肿瘤是中国乃至全世界最重要的死亡原因，肺癌已经跃居发病率和死亡率第1位的肿瘤，目前最主要的治疗手段还是手术、放疗和化疗。近年来免疫治疗取得了突破性进展，如食品药品监督管理局批准程序性死亡受体1抗体Keytruda用于非小细胞肺癌的一线治疗[1-2]。树突状细胞(dendritic cell，DC)是高度专职化的抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，不同成熟程度的DC具有不同的功能，不成熟的DC通过胞饮的方式来摄取抗原[3]，而分化成熟的DC能极大地刺激初始T细胞，识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)，从而对携带TAA的肿瘤细胞产生特异性的杀伤作用[4-6]。但在肿瘤患者体内树突状细胞的数量及机能都属于低下水平，并不能够很好的将肿瘤细胞清除[7]。

Toll样受体3(Toll-like receptor 3, TLR3)在肿瘤微环境中的激活可以提高免疫细胞的抗肿瘤作用，聚肌胞苷酸[polyinosinic:polycytidylic acid,Poly(I:C)]是一种TLR3激动剂，能促进DC的分化成熟，并将抗原呈递给T细胞，活化特异性的杀伤性T细胞，进一步诱导特异性的免疫应答[8-9]。已有文献报道,TLR7/8激动剂咪唑喹啉类化合物R848与Poly(I:C)联合应用比单一使用更能促进小鼠CD141+DC的分化成熟，这类DC比CD1c+DC呈递抗原给CD8+T细胞的能力更强。不仅如此，TLR3/7/8激动剂刺激DC，会上调DC表面共刺激分子和趋化因子受体的表达[10-11]。因此，本研究拟将R848与Poly(I:C)联合使用，诱导人DC分化成熟，并将肿瘤抗原递呈给T细胞，观察T细胞在体外特异性杀伤肺腺癌A549细胞的效果作用。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和耗材

AIM-V® CTSTM无血清培养基购于Life；人肺腺癌A549细胞系购于中国上海干细胞库；PE标记的抗CD11c单抗、APC标记的抗CD86单抗、APC标记的抗CD80单抗和APC标记的抗CD83单抗购于BioLegend；胎牛血清购于Gibco；RPMI-1640培养基和PBS缓冲液购于HyClone；白细胞介素4(interleukin-4，IL-4)、人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)ELISA试剂盒等购于PeproTech; R848和Poly(I:C)购于Sigma。

2 方法

2.1人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)分离、培养和鉴定 采集健康志愿者外周血肝素抗凝，经淋巴细胞分离液获得PBMC，采用经典分化方案诱导其向DC分化[12]；在培养第5天加入A549细胞裂解物(即肿瘤细胞裂解物,tumor cell lysate, TCL;32 mg/L);第6天加入R848 (2.5 mg/L)和Poly(I:C)(25 mg/L)[13-14];第7天收集DC，在显微镜下观察细胞的形态学特征，用流式细胞术(flow cytometry，FCM)分析DC表面分子的表达[15-16]。只加入TCL的DC为DC-TCL组，加入TCL和佐剂的DC为DC-R848+Poly(I:C)组，未加入TCL和佐剂的DC为DC-medium组。

2.2A549细胞裂解物的制备 培养A549细胞于RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素)中，待细胞融合到80%～90%进行细胞传代，收集处于对数期的A549细胞，计数，液氮和37 ℃水浴锅中反复冻融5次，3 000 r/mim离心10 min，吸取上清即为TCL，BCA法测定蛋白浓度，在未加入任何佐剂的情况下，向DC培养基中加入不同蛋白浓度的TCL，通过检测DC培养上清中的IL-12 p70的水平，筛选最佳抗原浓度[17]。

2.3FCM分析DC表面分子 收集经培养7 d后的DC，PBS洗涤后调整至1×109/L，各取100 μL细胞悬液，分别加入PE-CD11c单抗、APC-CD86单抗、APC-CD80单抗、APC-CD83单抗和APC-CD14单抗各10 μL，经过4 ℃孵育20 min，PBS洗涤2次，调整至1×109/L，FCM分析这些表面分子的表达[18]。

2.4细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)的培养 利用密度梯度离心法从外周血中分离PBMC，贴壁2 h后收获悬浮细胞即为T淋巴细胞[1]。将实验分为3组,DC-R848+Poly(I:C)组、DC-TCL组和DC-medium组的DC分别与T淋巴细胞按1∶10的比例混合培养，加入IL-2、IL-15和IL-21(均20 μg/L);第3天予以半量换液处理并加添加上述细胞因子;第7天收获细胞即为CTL。收集细胞上清液和细胞沉淀，通过ELISA检测培养上清液IFN-γ和TNF-α含量。

2.5乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放实验 为检测CTL的细胞毒效应，取A549细胞为靶细胞，以每孔2×104的密度接种于96孔板中，贴壁4～6 h后去上清，接种上述各组的CTL，以5∶1、10∶1和20∶1为效靶比，1% NP-40为靶细胞最大释放孔，16 h后于光学显微镜下观察细胞形态变化，拍照，离心5 min后，收集上清。LDH法检测其杀伤作用[酶标仪测波长为492 nm处的吸光度(A)]，以下列公式计算效应细胞的杀伤活性[13, 19]。细胞杀伤率(%)=(实验组A值-最小杀伤对照组A值)/(最大杀伤对照组A值-最小杀伤对照组A值)×100%。

3 统计学处理

实验数据采用Prism统计作图软件分析处理，多组之间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 DC的培养与表型鉴定

光学显微镜下观察，成熟的DC可见典型的细胞突起，见图1A;流式细胞术结果表明，90%以上的细胞表面有CD11c表达，见图1B;经过R848联合Poly(I:C)刺激的DC具有更长的细胞突起，见图1C;经R848联合Poly(I:C)刺激后CD83阳性表达率达80%以上，CD80阳性表达率达90%以上，而单核细胞的特征性标志CD14表达小于5%，DC-R848+Poly(I:C)组与DC-TCL组比较CD83和CD80表达明显增加(P<0.05)，CD14表达显著降低(P<0.05),各组之间CD86表达无明显差异，见图1D。

Figure 1. Identification of dendritic cells (DC). A: the morphological observation of DC (×400); B: the expression level of CD11c on the DC surface; C: characteristics of DC in different groups; D: CD80/CD83/CD86/CD14 expression on the DC surface in different groups. Mean±SD．n=3.*P<0.05vsDC-medium group;#P<0.05vsDC-TCL group．

图1鉴别树突状细胞

2 筛选A549细胞裂解物作为抗原的最佳浓度

在未加入联合佐剂的情况下，DC培养基中加入不同蛋白浓度的TCL，通过检测DC上清中的IL-12 p70的水平，筛选出最佳抗原浓度为32 mg/L，见图2。

3 R848和Poly(I:C)刺激后的DC培养上清中 IL-12 p70的含量

ELISA结果显示，经过R848和Poly(I:C)刺激后，DC分泌IL-12 p70的量较DC-TCL组显著增加，差异有统计学显著性(P<0.01)，见图3。

Figure 2. IL-12 p70 level in the culture supernatant of DC treated with different concentrations of antigen was tested by ELISA. Mean±SD．n=3．**P<0.01vs0 mg/L.

图2ELISA法检测经过不同浓度的抗原处理后DC培养上清液中IL-12p70的含量

Figure 3. IL-12 p70 level of each group was detected by ELISA. Mean±SD．n=3．**P<0.01vsother groups.

图3ELISA法检测培养7d后DC培养上清液中IL-12p70的含量

4 抗原致敏DC诱导的CTL对A549细胞的特异性杀伤效果

LDH释放实验显示,效靶比为10∶1和20∶1时，DC-R848+Poly(I:C)组CTL对A549细胞的杀伤率明显增高(P<0.01)，而DC-medium组与DC-TCL组之间无明显差异;当效靶比为5∶1时，各组CTL对A549细胞的杀伤作用无明显差异，见图4。

Figure 4. Cytotoxicity was tested by LDH assay. Mean±SD．n=3．##P<0.01vsother groups.

图4检测不同效靶比的效应T细胞对靶细胞的杀伤能力

5 DC与T细胞共培养上清液中IFN-γ和TNF-α的水平

ELISA结果表明，经DC-R848+Poly(I:C)组DC与T细胞共培养上清液中IFN-γ和TNF-α含量与DC-medium和DC-TCL组相比均显著升高(P<0.01)，见图5。

Figure 5. The levels of IFN-γ(A) and TNF-α(B) in the co-culture (7 d) supernatant of DC and T cells (1∶10) detected by ELISA. Mean±SD．n=3．**P<0.01vsother groups.

图5DC与T细胞(1∶10)共培养7d后检测细胞上清中IFN-γ和TNF-α的水平

讨 论

在肺癌中非小细胞肺癌占85%，其中腺癌占50%以上。由于早期肺腺癌不易发现及晚期患者由于转移耐药等原因，5年生存率不足15%[20]。近年来免疫靶向治疗发展迅速，为肺癌的治疗带来了曙光[21]。

DC是最有效的抗原呈递细胞。未成熟的DC抗原摄取能力强，通过内吞作用捕获外源性的抗原，释放到其细胞质间隔中；成熟的DC抗原呈递能力增强，并经过主要组织相容性复合体I类抗原呈递途径，呈递给CD8+T细胞，并诱导产生肿瘤抗原特异性的CTL，在免疫治疗中发挥重要作用[18, 20, 22]。

机体的免疫功能与肿瘤的发生、发展密切相关，其中T细胞的作用尤为关键。CTL的主要组织相容性I类复合体有肿瘤来源的多肽，这样就能够锁定并激活和它结合的T细胞抗原受体，使T细胞增殖并产生抗肿瘤特性[23]。经过抗原刺激的DC能将抗原呈递为表位的小分子，以抗原肽的形式与CD8+T细胞的主要组织相容性I类复合体相结合，并且T细胞能识别DC表面共刺激分子CD80(B-7.1)和CD86(B-7.2)信号，由此DC活化了T细胞，诱导T细胞产生特异性的细胞毒作用。成熟活化的T细胞通过分泌炎性细胞因子发挥特异性的抗肿瘤效应，IFN-γ和TNF-α是最主要的抗肿瘤炎性因子[4]。在本实验中，通过R848和Poly(I:C)刺激后的DC可诱导T细胞成为CTL，使CTL发挥对A549细胞的特异性杀伤作用，并随着效靶比的提高而增强，CTL分泌IFN-γ和TNF-α的能力也较DC-TCL组和DC-medium组显著提高。

TLR激动剂能改变抗原的物理性状，延缓抗原降解，从而增强DC对抗原的摄取和呈递能力，更有效刺激淋巴细胞的增殖和分化。理想的佐剂须安全且无长期毒副作用。R848是一种咪唑喹啉类化合物，为水溶性合成小分子，可以通过TLR7/TLR8-MyD88依赖性信号通路活化免疫细胞[8],由于其内毒素含量很低，不影响正常细胞的生理功能。Poly(I:C)是TLR3激动剂，能促进DC成熟、趋化迁移和促炎细胞因子的产生[24]。基于文献报道，目前仍然缺少致敏DC的特异性的抗原，全细胞裂解物含有最广谱的抗原，可能是刺激DC抗原递呈的最佳抗原[25-26]。

本研究结果显示，经过R848和Poly(I:C)的刺激后的DC，其表面分子CD11c、 CD80和CD83表达明显升高，而单核细胞的特征性标志CD14表达小于5%。IL-12 p70是肿瘤免疫中很重要的免疫启动因子，DC是分泌IL-12 p70最主要的免疫细胞，IL-12 p70的分泌能激活NK细胞和CTL的免疫活性。经过R848和Poly(I:C)刺激后的DC，其上清中IL-12 p70的含量可达300 ng/L以上，显著高于DC-TCL组和DC-medium组，而DC-TCL组和DC-medium组的IL-12 p70水平无明显差异。这是由于病原体相关分子模式是通过结合DC表面特定受体来增强其抗原呈递能力的，单使用TCL不足以刺激DC抗原交叉呈递作用，无法有效活化初始T细胞。研究表明TLR激动剂结合DC表面受体，是形成DC抗原呈递电位的有效佐剂[27-28]。

本研究也发现，经过R848和Poly(I:C)刺激后的DC致敏效应T细胞中CD4+/CD25+/Foxp3+Treg细胞的数量减少，并刺激产生了分泌IFN-γ的肿瘤抗原特异性CD8+T细胞。据文献报道，TLR4激动剂单磷脂酰A、TLR9激动剂CpG、TLR4激动剂LPS等也能刺激DC分化成熟[24, 29]。本课题组也将对其它TLR激动剂进行研究。本实验发现R848和Poly(I:C)对DC刺激后，DC的表面成熟分子显著上调，将抗原递呈给T细胞，经刺激后的DC诱导的T细胞分泌TNF-α和IFN-γ能力显著提高(P<0.01)，而DC-TCL组和DC-medium组T细胞分泌TNF-α和IFN-γ能力无明显差异，且R848和Poly(I:C)刺激后的DC可明显提高致敏T细胞对肺腺癌A549细胞的杀伤效果。

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