皮质酮抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞NLRP3表达及与XO的关系*

吴 玲， 田泽丹， 陈 楠， 胡 薇， 周成富， 杜 权

(重庆医科大学附属第二医院麻醉科， 重庆 400010)

在围手术期，机体针对组织损伤和感染应激发生炎症反应，适度的炎症反应有利于机体发挥防御能力，当丧失局部控制或激发全身反应时，即发生全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体是一种存在于细胞质中的多蛋白复合物，是介导炎症反应的关键复合体，主要由NLRP3、含胱天蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)和caspase-1前体组成。当宿主受到微生物刺激或者内源性损伤刺激信号时，NLRP3被激活，通过ASC招募caspase-1前体组装成活化的炎症小体，产生有活性的caspase-1，剪切白细胞介素(interleukin, IL)-1β和IL-18的前体使其成熟，发挥促炎作用[1-2]，其中NLRP3的表达水平是决定NLRP3炎症小体活性的主要因素。皮质酮(corticosterone，CORT)是应激时下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴的最终直接产物，通过调控炎症作用而维持内环境的稳定[3]，但皮质酮对炎症的调控是否与介导NLRP3的表达降低有关，尚不明确。近年来国内外相关研究报道称多种结构各异的分子可激活NLRP3炎症小体，它们均能促进信号分子活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生，后者可能是它们活化NLRP3炎症小体的共同主要机制[4-6]，而且目前较为认可的是线粒体来源的ROS[7-8]。已有研究指出，黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)主要介导线粒体ROS的产生[9]，所以假设CORT是通过XO调控巨噬细胞内NLRP3炎症小体的活化。本研究拟构建NLRP3炎症小体的活化模型，探讨XO对CORT调控细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW 264.7内NLRP3炎症小体的影响，进一步为探讨CORT发挥抗炎作用的机制进行深入研究，以提供调控炎症的新靶点。

材 料 和 方 法

1 实验材料

小鼠巨噬细胞株RAW 264.7由重庆医科大学感染实验室惠赠。LPS、别嘌呤醇(allopurinol，XO拮抗剂)和CORT均购自Sigma；抗黄嘌呤氧化酶抗体购自Abcam；抗NLRP3抗体购自CST；抗GAPDH抗体购自Bioworld；抗caspase-1抗体购自ImmunoWay；RNAiso Plus、Prime Script RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq 均购自TaKaRa；NLRP3、XO和GAPDH的mRNA引物由TaKaRa合成；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和抗生素购自HyClone；DMED培养基购自Gibco。

2 方法

2.1细胞培养、构建炎症模型 RAW 264.7细胞系培养于含10% FBS和1%抗生素(100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素)的DMED培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞处于对数生长期时，加入LPS致最终浓度为1 mg/L，使细胞形态变成多角形，伸出伪足数量明显增多，构建成熟的炎症模型。

2.2CORT浓度梯度的设置 分别用浓度为100、300、500、700和900 μg/L的CORT预处理巨噬细胞1 h，再构建炎症模型(1 mg/L LPS)，1 h后提取细胞总蛋白为实验对象。

2.3药物预处理及时间梯度的分组设置 LPS组细胞在构建炎症模型后0、0.5、1、1.5和2 h提取细胞成分,0 h为对照(control)组；CORT+LPS组细胞加入CORT致最终浓度为700 μg/L预处理1 h，构建炎症模型后于0.5、1、1.5和2 h提取细胞成分；allopurinol+LPS组细胞加入allopurinol至最终浓度为250 mg/L预处理1 h，构建炎症模型后于0.5、1、1.5和2 h提取细胞成分。

2.4Western blot法检测NLRP3、caspase-1和XO蛋白的表达 按细胞总蛋白提取试剂盒提取各组细胞的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。经过高温变性使蛋白性质稳定，各孔分别加入样品蛋白30 μg，经过电泳、湿转将蛋白转移至PVDF膜上，在TBST缓冲液(含5%脱脂奶粉)中于室温封闭1 h，分别按说明书加入相应稀释浓度的Ⅰ抗于4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，再加入相应稀释浓度的Ⅱ抗于室温孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL法显影蛋白印迹，实验重复3次。

2.5Real-time PCR法检测NLRP3和XO mRNA的表达 弃各组细胞的培养上清，无菌无酶的PBS缓冲液清洗贴壁细胞3次，加入1 mL RNAiso Plus，吹打40～60次，使细胞充分裂解，动作轻柔，按RNAiso说明书提取各组细胞总RNA，使A260/A280均在1.8～2.0之间。按逆转录试剂盒说明书进行逆转录及扩增。PCR扩增条件为95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法行PCR产物相对定量分析，实验重复3次。引物采用Primer Premier 5.0软件设计，序列见表1。

3 统计学处理

实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.0统计学软件对数据进行分析，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

表1 引物序列

结 果

1 LPS诱导NLRP3的表达

1.1LPS上调NLRP3的蛋白表达 1 mg/L的LPS处理巨噬细胞，在0.5 h～2 h间NLRP3的表达水平均有不同程度增加，相比对照组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，于2 h表达量最高，见图1。

Figure 1. The protein levels of NLRP3 in the RAW 264.7 cells treated with LPS at 1 mg/L. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图1LPS(1mg/L)刺激巨噬细胞后不同时点NLRP3蛋白水平的变化

1.2LPS上调NLRP3的mRNA表达 在LPS刺激后1 h～2 h NLRP3的mRNA表达水平高于对照组(P<0.05或P<0.01)，0.5 h的mRNA表达水平稍增加，但差异无统计学显著性，见图2。

2 CORT对NLRP3和caspase-1的蛋白表达的影响

当CORT低于300 μg/L时，NLRP3的蛋白水平与对照组相比显著上调(P<0.05)；当CORT高于700 μg/L时，NLRP3的蛋白表达明显减少(P<0.05)，并同步减少cleaved caspase-1的蛋白水平(P<0.05)，见图3。

Figure 2. The mRNA expression of NLRP3 in the RAW 264.7 cells treated with LPS at 1 mg/L. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

图2LPS(1mg/L)刺激巨噬细胞后不同时点NLRP3mRNA的相对表达情况

3 CORT下调NLRP3表达的同时抑制XO的表达

3.1CORT使NLRP3和XO的蛋白表达减少 与LPS组相比，CORT逐渐降低NLRP3的蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)，至2 h表达量最低；在CORT作用后1.5 h和2 h XO的蛋白表达亦减少(P<0.05)，于2 h最低，见图4。

3.2CORT下调NLRP3和XO的mRNA表达 在CORT+LPS作用后0.5 h至2 h,NLRP3的mRNA表达与LPS组相比显著下调(P<0.01)；XO在1.5 h和2 h的mRNA表达亦显著下调(P<0.05)，见图5。

4 Allopurinol减少NLRP3的表达

4.1Allopurinol减少NLRP3的蛋白表达 在allopurinol+LPS处理后，NLRP3在1 h至2 h的蛋白表达量相比LPS组显著降低(P<0.01)，见图6。

4.2Allopurinol下调NLRP3的mRNA表达 在allopurinol+LPS处理后1 h至2 h，NLRP3的mRNA表达水平低于LPS组(P<0.01)，见图7。

讨 论

在发生急性炎症的早期，机体启动促炎和抗炎2种机制，决定着炎症的发生、发展和转归，巨噬细胞等炎症细胞渗出是炎症反应最主要的特征，它作为重要的天然免疫细胞，在炎症调控中发挥着重要的作用。本研究以小鼠巨噬细胞RAW 264.7作为实验对象，用脂多糖构建炎症模型，结果表明在炎症发生的2 h内，NLRP3表达增强，于2 h反应最活跃。NLR作为重要的胞内模式识别受体，激活后形成炎症小体复合物，而NLRP3的表达水平是决定NLRP3炎症小体活性的主要因素。本实验证明LPS可激活巨噬细胞内的NLRP3炎症小体通路，促进炎症的发生，与已有研究结果一致[10-11]，构建了由LPS激活NLRP3炎症小体的模型。机体在围术期受到应激时，HPA轴被激活，释放糖皮质激素，可显著抑制LPS介导的鼠巨噬细胞炎症反应，而CORT作为啮齿类动物最主要的内源性糖皮质激素，发挥抗炎作用与介导炎症小体的表达降低有关。本研究选用0～900 μg/L皮质酮主要是为了观察不同应激条件下皮质酮的免疫调控作用。Dhabhar等[12]研究指出，50 μg/L CORT等同于机体在应激时产生的生理皮质酮水平，对巨噬细胞产生免疫刺激作用，在一定程度上对机体在早期适应急性应激作出了解释。本研究结果说明，低于300 μg/L的CORT促进炎症小体的释放以刺激机体的免疫功能，但700 μg/L时反而抑制作用最明显，发挥强效的抗炎作用。

Figure 3. The protein levels of NLRP3 and caspase-1 in the RAW 264.7 cells treated with CORT at different concentrations. Mean±SD.n=6.*P<0.05,P<0.01vs0 μg/L.

图3不同浓度的CORT与LPS(1mg/L)刺激细胞后NLRP3和cleavedcaspase-1蛋白水平的变化

Figure 4. The protein levels of NLRP3 and XO in the RAW 264.7 cells treated with CORT and LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

图4CORT(700μg/L)与LPS(1mg/L)作用于巨噬细胞后各时点NLRP3和XO蛋白水平的变化

Figure 5. The mRNA expression of NLRP3 and XO in the RAW 264.7 cells treated with CORT and LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

图5CORT(700μg/L)与LPS(1mg/L)作用于巨噬细胞后各时点NLRP3和XO的mRNA相对表达情况

Figure 6. The protein levels of NLRP3 in the RAW 264.7 cells treated with allopurinol and LPS. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.

图6Allopurinol(250mg/L)预处理及LPS刺激巨噬细胞后不同时点NLRP3蛋白水平的变化

Figure 7. The mRNA expression of NLRP3 in the RAW 264.7 cells treated with allopurinol and LPS. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsLPS group.

图7Allopurinol(250mg/L)预处理及LPS刺激巨噬细胞后不同时点NLRP3的mRNA相对表达情况

CORT通过抑制NLRP3炎症小体的活性发挥抗炎作用，但调控炎症小体的机制复杂不清，目前国内外相关研究较少。现研究已证实多种途径可激活NLRP3炎症小体，如细胞内的ROS、组织蛋白酶B(cathepsin B)和胞内蛋白激酶R等，其中细胞内ROS在LPS活化的NLRP3炎症小体中发挥着重要的作用[13-15]，ROS可直接促硫氧还原蛋白互动蛋白与NLRP3结合，进而激活NLRP3并组装成活化的炎症小体，促进炎症反应的发生[16]，尤其与线粒体ROS关系密切。Ives等[9]研究表明，XO介导线粒体ROS的产生，并调节巨噬细胞内NLRP3炎症小体的激活及促炎因子的剪切。因此，本实验假设在调控炎症反应的小鼠巨噬细胞中，CORT下调NLRP3炎症小体的活性与抑制XO的表达水平有关。本实验结果表明，较高浓度CORT(高于700 μg/L)在炎症发生的2 h内下调NLRP3的表达，减轻LPS诱导的鼠巨噬细胞炎症反应，同时抑制XO的表达水平，可见较高浓度CORT(高于700 μg/L)对LPS诱导的鼠巨噬细胞内NLRP3表达的抑制作用。XO的拮抗剂allopurinol使NLRP3的表达水平降低，说明NLRP3的表达与XO有关。

本研究初步确认，较高浓度CORT能抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞内NLRP3的表达，后者与XO有关，而CORT的抑制作用可能与其下调XO的表达水平有关。此结果进一步说明XO作为线粒体ROS的工具酶，介导了LPS诱导的小鼠巨噬细胞内NLRP3炎症小体的表达，而皮质酮通过调控XO抑制NLRP3炎症小体的活化，后续有待于进一步在人巨噬细胞中加以验证。本研究阐释了内源性糖皮质激素发挥抗炎效应的机制，为炎症的干预措施提供了新工具。

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