人类疱疹病毒5型6型与扁平苔藓相关性研究

王 君 陈官芝 管成飞 王莹莹

扁平苔藓(lichen planus，LP)是一种慢性炎症性皮肤病，常累及皮肤、甲、毛发和黏膜。皮肤扁平苔藓(Cutaneous lichen planus, CLP)常侵犯四肢屈侧皮肤。口腔扁平苔藓(Oral LP，OLP)可以作为独立的临床症状出现，也可以伴发于皮肤扁平苔藓或其他黏膜部位损害。LP的患病率约占人群的0.5%～2%，最常影响中年人(31～60岁)，男女发病率基本相等或女性稍多[1]。LP是一种自限性疾病，1个月～7年可消退。LP的病因和发病机制尚未完全明了，有关病因包括自身免疫、感染(细菌或病毒)、代谢和遗传等。近年来病毒因素在LP发病中的作用引起了很多学者的重视，LP与人乳头瘤病毒(HPV)、肝炎病毒、人类疱疹病毒(HHV)等相关的研究均有报道。目前的研究相对集中于口腔扁平苔藓，对皮肤扁平苔藓的研究相对较少。本研究应用Real Time PCR法检测扁平苔藓皮损组织及正常人皮肤组织中人类疱疹病毒5型6型的存在情况，探讨此两型病毒与扁平苔藓发病的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集青岛大学附属医院皮肤科2016年5月至2017年7月期间经组织病理检查确诊的20例扁平苔藓患者皮损组织标本，其中男9例，女11例，年龄23～62岁，平均(45.8±9.7)岁。另收集17名健康人美容外科手术正常皮肤组织，其中男8名，女9名，年龄25～58岁，平均(43.71±9.8)岁。两组标本性别和年龄差异均无统计学意义。所有样本保存于-80℃环境中。

1.2 试验方法与步骤

1.2.1 DNA提取 取20例LP患者皮损及17名健康对照者皮肤组织(定量10 mg)，使用病毒DNA纯化试剂盒(TaKaRa Code NO.9766，购自宝生物工程大连有限公司)，严格按照试剂盒操作步骤纯化提取DNA。得到的DNA提取液置于-4℃环境中保存待用。

1.2.2 实时定量PCR检测 采用Real Time PCR的Cycleave探针法。

1.2.2.2 标准曲线制作 用EASY Dilution将构建的DNA标准品10倍梯度稀释作为模板进行Real Time PCR反应，制作标准曲线(图1～4)。

1.2.2.3 样本HHV-5及HHV-6定量DNA检测 采用Real Time PCR检测样本，记录Ct值，计算HHV-5及HHV-6 DNA拷贝数。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行分析。扁平苔藓组与对照组病毒检测阳性率比较采用Fisher确切概率法(Fisher exact probability test)。两组样本阳性标本的DNA拷贝数比较采用t检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

两组所有样品进行HHV5基因检测时均没有扩增。20例扁平苔藓皮损组织样本中有16例(16/20,80%)HHV-6DNA扩增，17名健康人皮肤组织中有9名(9/17,52.94%)HHV-6DNA扩增，经统计学检验，两组样本HHV-6阳性率差别无统计学意义(表1)。两组中HHV-6阳性标本的DNA浓度(拷贝数)间差异无统计学意义(表2)。

图1 HHV-5定量反应曲线

图2 HHV-5定量标准曲线

图3 HHV-6定量反应曲线

图4 HHV-6定量标准曲线

表1 HHV-6实验组与对照组阳性例数的组间比较

注：Fisher确切概率法(Fisher exact probability test)P>0.05

表2 两组中HHV-6阳性样本的DNA拷贝情况

注：t=0.509，P>0.05

3 讨论

人类疱疹病毒5型(Human Herpesvirus 5, HHV-5，巨细胞病毒Cytomegalovirus，CMV)是DNA病毒，在人群中感染非常普遍，普通成人中45%～50%曾被HHV-5感染，幼年生活在贫困地区的人感染率甚至可以达到100%[2]。但大多数呈临床不显性感染或潜伏感染，单核细胞是HHV-5潜伏的载体之一[3]，HHV-5有嗜腺体细胞性，唾液是病毒释放传播的途径。人类疱疹病毒6型(Human Herpesvirus 6,HHV-6)是1986年从艾滋病合并淋巴细胞增生性疾病患者的外周血单个核细胞中分离出的一种病毒。与其他疱疹病毒相似，急性感染恢复后，病毒可长期潜伏在体内，一旦机体免疫力降低，病毒可激活致病。HHV-6是至今发现的唯一一种可以将其DNA整合至宿主细胞染色体上的疱疹病毒。病毒可分为HHV-6A和HHV-6B两型。HHV-6B的感染呈全球分布，据估计2岁以上人群的HHV-6抗体阳性率>95%[4]。在体外培养中，HHV-6可以感染T细胞、成纤维细胞、NK细胞、上皮细胞、内皮细胞等。

HHV-5及HHV-6的感染或再激活与许多疾病相关联。有学者对HHV-5及HHV-6与口腔扁平苔藓做了相关研究，结论尚有争议。Ghodratnama等[5]在OLP患者黏膜组织中检测到HHV-5DNA(2/20)、HHV-6DNA(4/20)及HHV-5、6DNA共同阳性，但没有统计学意义，不能确定与OLP的发病有关联。顾杨等检测了OLP患者及健康对照者的不同标本中4种人类疱疹病毒DNA,发现HHV-5与OLP的发病相关联，但HHV-6、HHV-7与OLP的发病关系不能确定[6]。人类疱疹病毒与皮肤扁平苔藓(CLP)的关系研究较少，Nahidi等[7]的研究认为HHV-7与LP的发病相关。

在我们的研究中，所有组织样本均未检测到HHV-5DNA,推测扁平苔藓的发病与HHV-5的局部感染无关。与顾杨等[6]对OLP的研究结果不一致，考虑可能的原因有：1)皮肤样本DNA含量较低；2)HHV-5病毒不在皮肤组织中感染复制；3)HHV-5有嗜腺体细胞性，可能OLP与CLP在发病机制上存在不同的诱发因素。20例扁平苔藓皮损样本中有16例(16/20,80%)HHV-6DNA扩增，17名健康人皮肤组织中有9名(9/17,52.94%)HHV-6DNA扩增，CLP组阳性率高于健康对照组，但两组样本HHV-6阳性率差别无统计学意义。与Ghodratnama等[5]的研究结果类似。扁平苔藓是一种病因复杂的免疫相关性疾病，诱发因素很多。包括人类疱疹病毒在内的很多感染因素在诱发扁平苔藓发病过程中所扮演的角色有待进一步研究。

[1] Bhattaeharya M，Kaur I，Kumar B．Lichen planus：a clinical and epidemiologieal study[J].J Dermatol，2000，27(9)：576-582.

[2] Mustakangas P, Sarna S, Ammala P, et al.Human cytomegalovirus seroprevalence in three socioeconomically different urban areas during the first trimester:a population-based cohort study[J].Int J Epidemiol,2000,29(3):587-591.

[3] 金奇.医学分子病毒学[M].北京：科学出版社，2001.716.

[4] Hall C.The epidemiology of human herpesvirus 6(HHV6)[J].J Clin Virol,2006,37(2):103.

[5] Ghodratnama F, Riggio MP, Wray D.Search for human herpesvirus 6, human cytomegalovirus and varicella zoster virus DNA in recurrent aphthous stomatitis tissue[J].J Oral Pathol Med,1997,26(4):192-197.

[6] 顾杨，李晶泉，李明汉，等.人类疱疹病毒5～8型与口腔扁平苔藓发病间的关系[J].国际口腔医学杂志,2010,37(4):386-391.

[7] Nahidi Y, Tayyebi MN, Ghazvini K, et al.Association of classic lichen planus with human herpesvirus-7 infection[J].Int J Dermatol,2017,56(1):49-53.