接触性检材的DNA自动化提取

王颖希，张庆霞，薛卢艳，李 程，杜 娟，霍振义，焦章平

（北京市公安司法鉴定中心，北京 100192）

案件接触性检材主要指人体与物体接触所遗留的表皮脱落细胞（下文简称脱落细胞），故嫌疑人使用的工具、戴过的手套、遗留的指纹等都可能含有不同数量的脱落细胞。接触性检材的DNA含量微，降解程度高，目前公安DNA实验室主要以磁珠法提取，工作量大、耗时长。但接触性检材数量却日益增多，而对检验时间的要求越来越迫切，故DNA检验工作的压力越来越大[1-3]。DNA提取是检验的关键，获得的DNA模板质量直接影响着后续实验。自动化工作站提取方式具有高通量批量处理功能，可有效提升检材处理效率，降低劳动强度[4]。但以往的自动化提取方法对微量DNA的提取能力存在不足，能否适用于批量处理接触性检材还需进一步改进和验证[5,8]。本文以KingFisher磁珠纯化仪结合超微量磁珠法提取试剂盒，建立了自动、高通量提取接触性检材DNA的新方法。测试结果显示该方法适用检材范围广，样品处理效率高，DNA有效检出率达71.5%，效果令人满意。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

标准品 2800 M（浓度：10 ng/μ L，promega公司）；自制指纹样本，7人的食指、中指、无名指分别在载玻片上各按一枚指纹，力度适中，按压时间5 s左右，共21枚指纹样本。本实验室日常案件送检的接触性检材（均为棉签擦拭脱落细胞或脱落细胞粘取器粘取的脱落细胞，如窗框拭子、作案工具拭子、嫌疑人遗留现场物品的粘取物等），共计870份，检材未做区分。KingFisher磁珠提取纯化系统（低通量版及高通量版）（博坤生物公司）、ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒（博坤生物公司）、ProFlex™ PCR系统（Thermo公司）、3500xL基因分析仪（ABI公司）、ID Plus扩增试剂盒（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取

不同起始量标准DNA的回收实验。取DNA标准品 2800M（10 ng/μ L）5μ L 加入到 495 μ L 高纯水中，稀释成0.1 ng/μ L的纯DNA标准品；分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5 μ L稀释后样本，使用ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒对其消化，进行0.1、0.15、0.2、0.25 ng纯DNA回收实验，洗脱体积为30 μ L，每个浓度平行进行10次试验。将预处理后的消化产物转移到KingFisher磁珠提取纯化系统（低通量版，24道）进行自动化DNA提取。

单枚指纹DNA提取实验。利用擦拭1号（博坤生物公司），按照干湿标准两步法对载玻片上指纹样本进行擦拭后放入1.5 mL离心管中。按试剂说明书使用ML-超微量磁珠法DNA提取试剂盒对其进行消化。将消化产物转移到KingFisher磁珠提取纯化系统（低通量版）进行自动化DNA提取。

案件接触性检材检验实验。棉签擦拭物检材直接剪取棉头表层并置于离心提篮内；脱落细胞粘取器粘取物直接取整个膜片放入1.5 mL离心管管底。除KingFisher磁珠提取纯化系统选用高通量版外，其余同“单枚指纹DNA提取实验”操作。

1.2.2 扩增及电泳分析

提取DNA的溶液采用ID Plus扩增试剂盒经ProFlex™ PCR系统，以10 μ L体系（模板均为1μ L）扩增。扩增产物经3500xL遗传分析仪进行检测，GeneMarker软件进行STR分型（RFU＞50）。未检出或检出10个基因座以下视为非有效检出，检出10个及以上基因座则作有效检出。

2 结果

2.1 不同起始量标准DNA回收实验

将各样本STR分型图谱与已知标准DNA分型进行比对，结果显示所有样本均得到准确分型（表1），但0.1 ng标准DNA样本有一个在D7S820基因座缺失一个位点，另一个其RFU峰值偏低，只有51。其他0.15、0.2、0.25 ng标准DNA样本均检出完整STR分型。

表1 不同起始量标准DNA回收样本检测结果Table 1 Standard DNA recoveries from different initial quantities of DNA

2.2 单枚指纹样本检测结果

将样本检出分型与被取样者的分型比对（表2），其中11个样本检出10个以上基因座的单一分型，且与被取样者分型一致；虽有1个混合分型，但以被取样者的分型为主要峰型。非有效DNA检出率为42.8%；有效DNA检出率为57.2%。

表 2 单枚指纹样本检测结果Table 2 Amount of exposed STR loci of the DNA extracted from single fingerprints

2.3 实际案件检材检测结果

870例实验检材检验结果见表3。

表 3 870例案件送检脱落细胞类检材检测结果Table 3 Statistics of detected STR loci of exfoliated cells from 870 contact samples collected in daily forensic casework

其中206个样本检出单一16基因座分型，22个样本检出单一13～15基因座分型，51个样本检出单一10～13基因座分型，343个样本检出混合16基因座分型；70个样本检出10基因座以下分型，178个样本未检出分型。未检出或10基因座以下分型视为非有效DNA提取，占比为28.5%；故有效DNA检出率为71.5%。

3 讨论

据文献报道，接触性检材DNA含量普遍在0.1～1.5 ng之间[9]。对这类微量疑难检材DNA的提取，需对从提取试剂到所用仪器的各个环节进行优化[10]。本研究选用KingFisher磁珠提取纯化系统结合博坤超微量磁珠法DNA提取试剂盒进行试验，得到了较高的检出率，原因可能如下：该试剂盒磁珠颗粒小，使其吸附DNA的面积更大，故可在磁珠表面富集更多的DNA，而其磁珠的超顺磁性又保证了更好的悬浮性和分散性；加之所选用自动化工作站采用磁棒插入磁套浸进液体进行吸附，磁套离开磁棒后置于溶液进行释放，相比通过磁力架反应的传统磁珠法可以提高检出率。另外，该系列仪器可根据检材条件而改变洗脱体积，故更有利于从微量脱落细胞样本中获得更高浓度的模板DNA。

本研究首先对选用的自动化提取系统进行提取灵敏度的测试。选择浓度可准确量化的标准DNA样本，结果显示该自动化系统可对含量低至0.1 ng的标准DNA成功回收，获得的STR分型也相对完整，表明该自动化系统具有较高的提取灵敏度。

指纹是案件现场典型的接触性检材，而其中脱落细胞含量却普遍较少，故属疑难类接触性检材。利用本文所建方法对实验室制备的单指纹样本进行提取，STR分析显示有效DNA检出率可达到57.2%，为目前指纹DNA检验的较好结果。而且，由于整个提取过程全部自动化处理，方法的重复性高，能为稳定可靠的大批量处理接触性检材DNA提供保障。在实际样本的验证实验中，所选取的均为实际案件现场经采样工具二次转移的接触性检材。经STR检验分析，有效DNA检出率达到71.5%，其中单一16基因座分型检出率为23.7%。这一结果即便与手工精细操作相比也令人满意，表明自动化系统应用于接触性检材批量提取纯化是切实可行的。

KingFisher磁珠纯化仪可应用于日常案件检验，其中高通量版可以同时处理96个样本。磁珠颗粒小，富集效率高，洗脱体积灵活，均有利于从微量接触检材中获得高浓度的模板DNA；又因其适用检材类型广，能有效提高各类检材DNA的检出率，因而可降低检验成本。磁珠法整合自动化工作站能有效控制人为因素对实验的影响，减少DNA损失，同时还可避免样本间的交叉污染，结果的准确性更有保障，实验时间更短，提取96个样本仅需1 h 3 min。

［1］ 王琴，章申峰，李佑英，等.微量脱落细胞DNA检验方法的比较分析[J].刑事技术，2014(4):54-55.

［2］ 骆继怀，陈晓军，孙红兵，等.接触性生物检材提取方法的比较[J].兰州大学学报：医学版，2015, 41(1): 18-22.

［3］ 廖长青，成静，刘维. Chelex-100法和QIAcube纯化法在接触性检材检验中的比较[J].法医学杂志，2015, 31(2):148-149.

［4］ 严江伟，王顺霞，任贺，等. 应用自动化工作站提取常见生物样本DNA [J]. 中国法医学杂志，2007,22 (2):73-75.

［5］ 郝宏蕾，吴微微，苏艳佳，等．批量陈旧血样DNA的自动化检验[J]．中国法医学杂志，2011，26（2）：122-123.

［6］ 姜先华，侯光伟，李军，等. 应用DNA工作站进行批量血斑STR分型的研究[J].中国法医学杂志，2007,22(1):1-4.

［7］ 高林林，洪亮，叶慧薇，等.脱落上皮细胞类生物检材的自动化提取[J].刑事技术，2011(2):14-15.

［8］ 徐韩飞，范京来，富渭鑫，等. QIAcube小型工作站在生物接触类检材提取中的应用研究[J].刑事技术，2015(2):118-121.

［9］ RAYMOND J J, OORSCHOT R A H V, GUNN P R, et al. Trace DNA success rates relating to volume crime offences[J]. Forensic Science International Genetics Supplement, 2009, 2(1):136-137.

［10］ 匡金枝，聂同钢，杨智，等．法医物证DNA自动化检验技术体系的研究[J]．中国法医学杂志，2009, 24(3): 164-167.