敌敌畏在血液中的分解动力学研究

夏侯秋锦，李 鹏，毕文姬，柏泽新，国 菲

（淄博市公安局刑侦支队，山东 淄博 255000）

敌敌畏（DDVP），是中毒率和死亡率较高的有机磷农药之一，常见于投毒事件，自杀事件以及食物误服中毒事件[1-3]。目前，国内外对敌敌畏的分解动力学研究报告较少，主要集中在敌敌畏的检测方法及农作物敌敌畏残留的检测[4-8]。在敌敌畏中毒案件中，由于送检不及时或实验室内部因素往往都会使得检材不能及时进行检验。同时，由于案件的需要，常常要求对所送检材进行再次、多次检验从而确定是否为敌敌畏中毒死亡，毒物会发生分解，需进行保存检材中分解动力学研究，明确保存检材中毒药物的检出时限，最佳存储条件，对于推断死亡当时或检材采取当时体内或检材内毒(药)物浓度意义重大[9]，而关于敌敌畏的分解动力学研究仅见一篇报告[10]，并且为单一浓度敌敌畏在动物血中的研究，没有系统全面地分析不同浓度敌敌畏在人血中的分解动力学规律。本文通过检测人血中5种不同浓度的敌敌畏在-20、4、20 ℃三种保存条件下含量的变化，更系统、更全面研究敌敌畏在人血检材中的分解动力学规律，为敌敌畏中毒案件的法医学鉴定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

AB公司4000Q TRAP液质联用仪、低温高速离心机、涡旋震荡器、移液器。

1.1.2 试剂

DDVP标准品（购于公安部物证鉴定中心）、甲醇、乙腈等有机溶剂均为色谱纯；试验用水均为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 样品制备：

取5份空白血液，分别添加敌敌畏浓度到0.36、0.72、1.5、3.0、5.3 μg/mL，将每份血再分为 3份，分别置于-20、4、20 ℃三种温度环境中，在1、2、4、6、8、12、16、20、24、28、32、40、48、64、80、96、120 d进行检测。

1.2.2 样品的处理

1 mL血液中加入2 mL乙腈，高速涡旋振荡5 min，12 000 r·min-1高速离心7 min，取上清液过0.22µm滤膜过滤，液质联用仪定性、定量分析。

1.2.3 液相色谱及质谱条件

色谱柱：Waters BEH C18 1.7 µm 2.1×50 mm Column；流速：0.3 mL/min；进样量：30 µL，流动相A为5 mM乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇。流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient setup

质谱：正离子扫描；检测方式为多反应监测；碰撞气为氮气；气帘气（CUR）：20 psi；喷撞气（CAD）：Medium；离子化电压（IS）：5500 V；温度（TEM）：500 ℃；喷雾气（GS1）：50 psi；辅助加热气（GS2）：50 psi；接口加热（ihe）：on；碰撞室入口电压（EP）：10 V；碰撞室出口电压（CXP）：6 V；保留时间：2.13 min；221.1/109.1的碰撞电压为24 eV，221.1/127.1的碰撞电压为21 eV，其中221.1/109.1为定量离子。

2 结果

2.1 色谱图及质谱图

空白血液及添加敌敌畏血液的液质联用仪色谱图及质谱图，如图1～2所示，结果显示在选择的实验条件下，血液中的杂质不影响敌敌畏的测定。

图1 空白血色谱图Fig.1 Chromatogram of blank blood

图2 血中添加敌敌畏色谱图及质谱图Fig.2 Chromatogram and mass spectrum of DDVP-spiked blank blood

2.2 回收率及精密度实验

精密吸取15份空白全血1 mL，分为3组，每组分别添加敌敌畏标准品，浓度为0.5、1、4 µg/mL，按1.2.2全血样品处理项方法处理测定，见表2。

表2 敌敌畏回收率及精密度(n=5)Table 2 Recoveries (REC) and relative standard deviations(RODS) of DDVP (n=5)

2.3 工作曲线

取空白全血分别添加敌敌畏标准品浓度为0.02、0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 2.0、 4.0、 6.0 µg/mL，按 1.2.2全血样品处理项方法处理测定，以峰面积（y）-敌敌畏浓度（x）为坐标做工作曲线，曲线方程为

y=7.63e5x+3.93e3，其r值为0.9991，线性范围为0.02 ～ 6.0 µg/mL，最低检出限为 0.002 µg/mL，S/N>3。

2.4 温度对保存血液中敌敌畏含量变化的影响

5种浓度敌敌畏在不同温度下血液中的含量变化见图 3～7。

图3 浓度为0.36 μg/mL的敌敌畏在不同温度保存血中含量变化Fig.3 DDVP of 0.36μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

图4 浓度为0.72 μg/mL的敌敌畏在不同温度保存血中含量变化Fig.4 DDVP of 0.72μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

图5 浓度为1.5 μg/mL的敌敌畏在不同温度保存血中含量变化Fig.5 DDVP of 1.5μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

图6 浓度为3.0 μg/mL的敌敌畏在不同温度保存血中含量变化Fig.6 DDVP of 3.0μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

图7 浓度为5.3 μg/mL的敌敌畏在不同温度保存血中含量变化Fig.7 DDVP of 5.3μg/mL changing under different temperatures for its preservation in blood

采用 WinNonlin 药代动力学软件处理保存血液的平均药物浓度-时间数据，结果显示，在 -20 ℃和4 ℃条件下分解均符合一级动力学过程一室开放模型，可以用Ct=Coe-αt(Ct 为时间 t 测得的含量；Co表示初始含量；t 表示时间，单位:d；α为分解速率常数)表示，在20 ℃保存环境下分解过快，不宜用动力学方程表示，分解动力学参数见表 4。

表4 敌敌畏分解动力学参数Table 4 DDVP decomposition kinetics parameters

同一保存环境不同浓度敌敌畏的分解速率常数α均相近，在-20 ℃保存环境下，分解速率常数α取平均0.023，分解动力学方程为Ct=Coe-0.023t，半衰期为30.13 d；在4℃保存环境下，分解速率常数α取平均0.35，分解动力学方程为Ct=Coe-0.35t，半衰期为1.98 d。浓度为3.0 μg/mL的敌敌畏在-20 ℃及4℃保存环境中浓度-时间曲线如下图8～9。

图8 浓度为3.0μg/mL的敌敌畏在-20℃保存环境中浓度-时间曲线Fig.8 The C-T (concentration-time) curve of DDVP at 3.0 μg/mL in blood stored under -20℃

图9 浓度为3.0μg/mL的敌敌畏在4℃保存环境中浓度-时间曲线Fig.9 The C-T (concentration-time) curve of DDVP at 3.0μg /mL in blood kept under 4℃

3 讨论

目前研究表明，保存检材中毒物的分解动力学主要受保存条件的影响，包括温度、时间、器皿类型、防腐剂、pH值及其它等[11]。其中，温度是影响保存生物检材中毒物分解主要因素之一，毒物在生物检材中的分解速度与保存温度相关。本实验采用血液中不同浓度的敌敌畏在-20、4、20 ℃保存条件下含量的变化，系统的研究敌敌畏在人血检材中的分解动力学规律。结果显示，不同浓度敌敌畏含量在-20、4、20 ℃保存条件中均呈下降趋势，随着温度的升高，敌敌畏降解速度加快。在-20 ℃条件下，保存120 d仍然可以检测到的敌敌畏的存在；在 4 ℃条件下，敌敌畏在 12 d后未能检出；在20 ℃条件下，4 d后即检测不出敌敌畏。由此可以得出：随着温度的升高，各检材中敌敌畏分解加快，稳定性降低。在-20 ℃条件下，敌敌畏具有较好的稳定性，在120 d仍可检出。这也提示日常工作中，由于各种原因导致采取检材后无法立即送检、检验的，应当低温保存。-20 ℃条件下，120 d检材中敌敌畏含量约为初始含量的 10%，因此在低温条件下保存的敌敌畏检材也应尽快送检、检验，以免长时间保存造成敌敌畏分解而无法检测。实验结果显示，用所拟合的Ct=Coe-αt公式和参数计算的血中敌敌畏的理论值与实测值接近，说明应用血中毒物分解动力学数学模型和参数，可以模拟生物检材中敌敌畏浓度的经时变化，估算检材保存期间任一时间的毒物浓度；同时显示在同一保存温度下，不同浓度的敌敌畏在血液中的分解速率常数α及半衰期相近，判断不同浓度的敌敌畏在同一保存条件下分解速率相近。在敌敌畏中毒（死）案件法医学鉴定时，可采用此分解动力学方程和参数来推断检材采取当时或中毒死亡当时的毒物浓度，正确分析和使用毒物分析结果，为敌敌畏中毒（死）案件法医学鉴定提供科学依据。

综上所述，敌敌畏在保存血液中极不稳定，分解很快，低温保存可以减缓其分解，分解动力学过程可用一级动力学过程一室开放模型来描述。敌敌畏中毒（死）案件法医学鉴定中，检材应低温冷冻保存，立即送检并检验。如果检材保存时间较长，可用其分解动力学方程和参数估算检材采取或送检当时的敌敌畏浓度。

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