莪术油对大鼠子宫内膜异位症基质细胞衍生因子-1及其受体表达的影响

刘 帅，曹保利

1天津中医药大学，天津 300193；2天津市南开医院妇产科

子宫内膜异位症是一种常见的妇科疾病，多发生于中青年育龄妇女，以痛经、不孕、慢性盆腔疼痛或性交痛为主要表现，严重影响女性的生活质量，近年发病率有上升趋势。子宫内膜异位症是指具有生长功能的子宫内膜组织在子宫腔体以外的部位种植，是一种雌激素依赖性和自身免疫反应性疾病，其表现往往与恶性肿瘤高度相似，具有侵袭、转移、增生、血管生成等特点，而且具有一定的恶变率[1]。相关研究[2]表明，基质细胞衍生因子(SDF-1)及其趋化因子受体4(CXCR4)构成生物轴广泛参与体内各种生理及病理过程。SDF-1/CXCR4在促进肿瘤细胞的增殖、黏附、定向转移、血管生成及降解细胞外基质、诱导免疫耐受中发挥着重要作用。有研究[3]发现，子宫内膜异位症患者的在位内膜、病灶周围组织及异位病灶组织中均有SDF-1和CXCR4的表达，且在异位病灶组织及在位内膜中的表达明显高于正常内膜组织，说明SDF-1/CXCR4参与了子宫内膜异位症的形成和发展。

本课题以往相关研究[4]证实复方莪术散可明显抑制SDF-1、CXCR4的表达且存在剂量依赖关系，说明复方莪术散可明显降低异位内膜组织中SDF-1、CXCR4的表达，对子宫内膜异位症有一定治疗作用。而莪术作为复方莪术散中的重要组成药物，具有行气破血，消积止痛之功效[5]。莪术提取的有效成分莪术油能显著减小异位内膜病灶的体积，抑制肿瘤血管生成[6]。为进一步认识莪术在复方莪术散中的作用，提高疗效，本实验观察莪术油对大鼠子宫内膜异位症SDF-1 mRNA及CXCR4 mRNA表达的影响，为复方莪术散的推广使用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康未育SD大鼠45只，清洁级，体质量200～250 g，购自中国医学科学院放射学院研究所实验动物中心，实验动物使用许可证号：SCXK(津)2005-0001，自然光照，常规饲养，适应环境后开始实验。

1.2 实验药品及试剂 莪术油(南开医院研究所提供)，根据有关研究[2]配制成1%的莪术油注射液，其中各成分的比例为莪术油:吐温 -80∶水(1∶2∶97)，此状态下的莪术油注射液理化性质最稳定，安全性较高；吐温-80、无水乙醇(天津市化学试剂供销公司提供)；戊酸雌二醇片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，国药准字J20130009)；RNA提取试剂盒和逆转录试剂(购自天津生化科技北京有限公司)。

1.3 实验仪器 MSC-ADVANTAGE 1.2型生物安全柜(赛默飞世尔科技公司)；CRH-100型恒温金属浴(天津市南开医院研究所提供)；KUBTOA 3500型冷冻离心机[北京(日本)久保田公司]；IQ5型RT-PCR仪(美国 Bio-Rad公司)；Thermo移液器(艾本德生命科学公司)；去RNA酶移液枪头(美国Axygen公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物模型 参照文献[1]制备非动情期SD大鼠EM模型：予10%的水合氯醛[0.3 mL/100 g(体质量)]腹腔注射麻醉大鼠，腹部手术区剃毛备皮，安尔碘常规手术消毒，于腹中线尿道口上1 cm处行纵向切开，长越1.5～2 cm，在距离右卵巢约1cm处，结扎右侧子宫远端局部血管及需切除的子宫段两端，剪下长约2～3 cm的子宫段，用眼科剪剪开子宫段，剪成5 mm×5 mm大小子宫组织(包括肌层)3块，以黏膜面朝向腹壁，浆膜面朝向腹腔(1块移植于肠系膜血管丰富处，另2块移植于腹壁血管丰富处)，然后进行四角缝合，向腹腔滴入以0.9%生理盐水溶解的青霉素16万/kg，而后关闭腹腔。于术后第10天灌注戊酸雌二醇0.2 mg/kg，1次/d，连续 5天。

1.4.2 分组及给药 造模3周后，将造模成功的32只大鼠按随机数字表法分为模型组及莪术油高、中、低剂量组各8只，另设8只健康大鼠作为空白组。空白组、模型组大鼠每天腹腔注射生理盐水1次，莪术油[7]低、中、高剂量组大鼠分别每天腹腔注射相应剂量莪术油 20、40、80 mg/(kg·d)。每组均连续给药28天。

1.4.3 标本获取 各组大鼠分别于末次腹腔注射给药后24小时内颈椎脱臼猝死，然后迅速开腹观察并取出异位内膜组织，快速放入液氮中留存，并转入-80℃冰箱保存，留作RT-PCR试验用。

1.5 检测指标 先将内膜组织中的总RNA提取，然后再将提取的RNA反转录为C-DNA(以上步骤按说明书严格操作，逆转录试剂盒和RNA提取试剂购自天津生化科技北京有限公司)，在经RNase Free处理过的 EP管中建立反应体系：2.5×RealMaster Mix 9 μL，正向引物 0.5μL，反向引物0.5 μL，DNA 模板 2 μL，超纯水 8 μL，最终反应体系为20 μL。采用 RT-PCR法检测各组大鼠内膜组织中SDF-1及CXCR4 mRNA的表达；引物设计为上 游 ：5′-ATGCCCCTGCCGATTCTTTG-3′，下 游 ：5′-TTGTTGCTTTTCAGCCTTGC-3′；CXCR4 上游：5′-CCCCATCCTCTACGCCTTCC-3′，5′-GTGTCCACCCCGTTTCCCTT-3′，β-actin上游：5′-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3′，5′-GGAAGGAAGGCTGGAAG-3′。反应条件为扩增条件：94℃预变性2分钟，1个循环；94℃变性 20 秒，35 个循环；SDF-1，CXCR4，内参 β-actin分别为55℃退火30秒，20秒，35个循环；68℃延伸1分钟，共35个循环。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行分析。计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型组、空白组大鼠子宫内膜组织SDF-1mRNA和CXCR4 mRNA的表达 模型组异位与在位子宫内膜组织中SDF-1 mRNA的表达比较差异有统计学意义(P＜0.05)。模型组与空白组在位子宫内膜组织SDF-1 mRNA的表达比较差异有统计学意义(P＜0.05)。模型组异位内膜组织、在位内膜组织及空白组在位子宫内膜组织均有CXCR4 mRNA的表达，且各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 SDF-1 mRNA和CXCR4 mRNA在各组大鼠子宫内膜中的表达(±s)

表1 SDF-1 mRNA和CXCR4 mRNA在各组大鼠子宫内膜中的表达(±s)

注：＊表示与空白组在位子宫内膜比较，P＜0.05；#表示与模型组在位子宫内膜比较，P＜0.05

组别 只数 m R N A S D F-1 C X C R 4模型组异位子宫内膜 8 1.3 3 3±0.1 1 0＊# 1.4 6 4±0.1 8 7＊#模型组在位子宫内膜 8 1.1 0 2±0.3 2 7＊ 1.0 5 1±0.2 1 3空白组在位子宫内膜 8 0.3 2 6±0.0 5 4 0.3 8 1±0.4 2 5#

2.2 SDF-1 mRNA和CXCR4 mRNA在各组大鼠异位子宫内膜组织中的表达 给药28天后，莪术油高、中、低剂量组SDF-1 mRNA比较差异有统计学意义(F=64.764，P＜0.05)，且各剂量组与模型组异位内膜组织SDF-1mRNA的表达比较，均有不同程度的下降(P＜0.05)。莪术油低剂量组与中剂量组CXCR4 mRNA比较差异无统计学意义(P＞0.05)；而高剂量组CXCR4 mRNA表达下降明显，与模型组及莪术油中、低剂量组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA在各组大鼠异位子宫内膜组织中的表达(±s)

表2 SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA在各组大鼠异位子宫内膜组织中的表达(±s)

注：＊表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 m R N A S D F-1 C X C R 4模型组异位子宫内膜组 8 1.3 3 3±0.1 1 0 1.4 6 4±0.1 8 7莪术油低剂量组 8 1.1 7 6±0.0 5 7＊ 1.1 9 0±0.1 4 6＊莪术油中剂量组 8 1.0 4 6±0.0 6 7＊ 1.0 6 4±0.0 7 5＊莪术油高剂量组 8 0.8 0 6±0.0 7 1＊ 0.8 4 6±0.0 4 2＊

3 讨论

SDF-1是CXC趋化因子亚家族的成员之一，又名CXCL12，它由骨髓基质细胞产生。而SDF-1具有高度亲和的特异性受体CXCR4，两者结合后形成的SDF-1/CXCR4生物学轴广泛参与体内的各种生理及病理过程。研究[7]表明SDF-1/CXCR4生物学轴对肿瘤的影响最为突出，在多种肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥重要作用。目前至少已发现有23种肿瘤细胞表面表达 CXCR4[8]，其中包括妇科方面的肿瘤如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌，而SDF-1/CXCR4与这些妇科肿瘤发生的多种机制相关，且有报道[9]证实SDF-1/CXCR4可通过激活多种信号通路而介导肿瘤细胞的运动、趋化、黏附、分泌(如 MMPs、VEGF)、血管生成、生长以及增殖等生物学行为。

子宫内膜异位症是妇科常见病、多发病，近几年其发病率呈上升趋势。子宫内膜异位症虽然为良性疾病，却具有黏附-侵袭-血管生成的病理表现的恶性行为。根据子宫内膜异位症患者在位内膜及异位灶组织中，均有SDF-1及CXCR4表达的研究报道[4]，本实验建立非动情期大鼠子宫内膜异位症模型，结果证实模型组大鼠异位内膜组织中SDF-1 mRNA及CXCR4 mRNA的表达明显高于正常在位内膜组织和模型组在位内膜组织，说明SDF-1/CXCR4在大鼠子宫内膜异位症形成过程中起到一定作用。

中医古代医籍中并无子宫内膜异位症病名的记载。但根据其主要症状及体征，中医大多将其归属于“痛经”“癥瘕”“不孕”等范畴。如《类证治裁·调经论治》记载：“至于经期前后腹痛，虚实悬殊。经未行而先痛者，血为气滞，经通则痛自除；经已行而犹痛者，冲脉本虚，血去则痛益甚。”《景岳全书·妇人规·癌瘕类》更为全面地总结了癥瘕之证乃“疲血留滞作癌，惟妇人有之，其证由经期，或由产后，凡内伤生冷，或外受风寒，或恚怒伤肝，气逆而血留，或忧思伤脾，气虚而血滞；或积劳成积，气弱而不行，总由血动之时，余血未净，而一有所逆，则留滞日积，而渐以成癥矣。”当代医家总结古人经验，结合现代临床研究，一致认为血瘀是子宫内膜异位症的基本病机[10]。在采取传统中医药治疗子宫内膜异位症的过程中，有学者通过研究发现莪术是使用最为频繁的中药之一，排在第3位[11]。莪术味辛、苦，性温，归肝、脾经，具有行气破血和消积止痛之功效，常用于治疗癥瘕痞块、瘀血经闭、胸痹心痛和食积胀痛等病症[12]；现代药理研究[13]表明，莪术具有抗肿瘤、消炎、抗氧化和抗肝毒性等作用。莪术油为莪术的非极性溶剂提取物所含的挥发油，其成分复杂，主要含有多种低沸点的倍半萜和单萜化合物。现代药理研究[14]证实，莪术提取物中有效成分包括莪术油(主要为莪术醇)、β-榄香烯、姜黄素等多种药理成分，具有抗炎、抗肝纤维化、抑制癌细胞增殖、促进凋亡等多种药理作用，在肿瘤、消化、精神疾病等方面广泛应用。这一点已在肝癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌中得到证实。如宋爱莉等[15]研究发现莪术油能够有效降低二羟甲基丁酸(DMBA)诱导大鼠乳腺癌前病变组织中VEGF mRNA的表达强度，抑制血管生成，促进乳腺癌细胞凋亡。

本实验对大鼠子宫内膜异位症组织中SDF-1、CXCR4表达的研究发现，大鼠子宫内膜异位症中在位内膜组织及异位内膜组织的SDF-1、CXCR4表达强度均高于正常子宫内膜组织的在位内膜组织。说明SDF-1、CXCR4可能参与子宫内膜异位症的发病过程，并起到一定作用。此外，随着给药剂量的增多，异位内膜组织中SDF-1、CXCR4的表达呈同步下调趋势，提示莪术油对大鼠子宫内膜异位症的治疗作用可能与抑制SDF-1、CXCR4的表达有关。

综上所述，SDF-1、CXCR4与子宫内膜异位症的发病存在一定关系，莪术油对大鼠子宫内膜异位症中SDF-1、CXCR4的表达具有明显抑制作用，而且浓度越高，抑制作用越强，说明莪术油对子宫内膜异位症的治疗有一定作用。此外，莪术作为复方莪术散中的“君药”，可能在治疗子宫内膜异位症中起关键作用。

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