敦煌医方大补肾汤对镉染毒模型大鼠肝组织细胞因子和氧化应激的影响*

康开彪，颜春鲁，姚贞宇，辛 阳

1甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州730050；2甘肃中医药大学；3兰州市第一人民医院

镉(Cadmium)是一种广泛存在于自然界中的银白色有光泽的重金属，可以通过各种途径进入机体，造成机体多器官、多系统损伤[1]。目前镉中毒的研究主要集中在肾、肺、肝、辜丸、骨骼等器官及血液系统[2]，免疫系统相关研究较少。本实验采用腹腔注射0.1%氯化镉建立镉染毒大鼠模型，通过观察敦煌古医方大补肾汤对染镉大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量及肝组织白细胞介素2(IL-2)和转化生长因子β1(TGF-β1)含量的影响，探讨其在镉导致氧化损伤和免疫毒性损伤方面的治疗作用，为该药防治镉中毒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级Wistar大鼠60只，体质量(180±20)g，雌雄各半，甘肃中医药大学科研实验中心提供，实验动物质量合格证号：SCXK(甘)2015-0002。

1.2 药物 乙酰半胱氨酸泡腾片(富露施，注册证号：H20090620，5.4 mg/mL)；大补肾汤水煎液(甘肃中医药大学附属医院药剂科制备，地黄90g，竹叶 90 g，甘草 90 g，泽泻 30 g，桂枝 30 g，干姜30g，五味子30g)制备好后置4℃冰箱保存，备用。

1.3 试剂 氯化镉(天津市巴斯夫化工有限公司，批号：20081010)；考马斯亮兰试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140309)；SOD活性和MDA检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140310和 20140305)；Rat IL-2 precocated ELISA kit和Rat TGF-β precocated ELISA kit检测试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号：20140509和 20140416)。

1.4 仪器 iMark型全自动酶标分析仪(美国Bio-Rad公司)；FA2004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；ZY12306型微量加样器(ScienTiFic产品)；T6新悦-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；TDZ5-WS型医用离心机(湖南平凡科技有限公司)。

1.5 动物分组、模型制备及给药 大鼠60只适应性喂养3天后，按照随机数字表法分为6组：正常对照组、模型组、乙酰半胱氨酸组及大补肾汤低、中、高剂量组，每组10只。正常对照组腹腔注射0.9%NaCl，其余5组均腹腔注射0.1%氯化镉，按1.5 mg/kg注射，每周5次，共5周。染毒的同时给予乙酰半胱氨酸泡腾片溶液(5.4 g/mL)及大补肾汤各剂量(高剂量：3.5g/mL，中剂量1.75 g/mL，低剂量0.875 g/mL)按照1 mL/100 g灌胃治疗，1次/d，连续5周。最后1次注射24小时后，取大鼠肝脏及脾脏、胸腺组织待用。

1.6 指标检测

1.6.1 免疫器官指数的测定 末次给药24小时后，称量大鼠体质量，眼球采血处死大鼠，摘取脾脏、胸腺等组织称重，分别计算脾脏指数及胸腺指数。脾脏(胸腺)指数=脾脏(胸腺)质量(mg)/体质量(g)。

1.6.2 肝组织SOD和MDA含量的测定 大鼠末次给药24小时后，动脉采血处死大鼠，制备10%肝组织匀浆液，比色分析法测定肝组织中SOD活性及MDA含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.6.3 肝组织IL-2和TGF-β1含量的测定 肝组织匀浆液制备同“1.6.2”，ELISA法测定肝组织IL-2及TGF-β1的含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法 数据采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氯化镉染毒大鼠的一般情况及处死前体质量变化情况 正常对照组大鼠进食、饮水、活动、大小便及呼吸状态良好，皮毛有光泽、毛色光亮；镉染毒组大鼠进食、饮水、活动均明显减少，精神萎靡、抑郁，毛色暗淡、稀疏。大补肾汤各剂量组大鼠进食、饮水、活动较模型组改善，皮毛有光泽、毛色光亮，精神状况良好。与正常对照组比较，模型组大鼠体质量减轻(P＜0.05)；与模型组比较，各给药干预组大鼠体质量均增加，大补肾汤中、高剂量组作用较显著(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠处死前体质量变化情况(±s) g

表1 各组大鼠处死前体质量变化情况(±s) g

注：#表示与正常对照组比较，P＜0.05；＊表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 体质量正常对照组 1 0 1 9 3.1 3±3 7.4 8模型组 1 0 1 4 4.4 0±1 1.5 5#乙酰半胱氨酸组 1 0 1 8 5.1 0±2 5.8 9＊大补肾汤高剂量组 1 0 1 8 5.1 4±2 2.9 3＊大补肾汤中剂量组 1 0 1 7 7.3 7±2 4.1 8＊大补肾汤低剂量组 1 0 1 7 2.5 0±1 2.0 5＊

2.2 大补肾汤对镉染毒大鼠脾脏指数和胸腺指数的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠脾脏指数和胸腺指数均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与模型组比较，各药物干预组大鼠脾脏指数均增加，大补肾汤高剂量组胸腺指数增加明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠脾脏指数及胸腺指数比较(±s) mg/g

表2 各组大鼠脾脏指数及胸腺指数比较(±s) mg/g

注：#表示与正常对照组比较，P＜0.05；＊表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 脾脏指数 胸腺指数正常对照组 1 0 3.9 6±0.7 0 1.6 9±0.5 0模型组 1 0 1.8 6±0.4 3# 0.7 2±0.3 3#乙酰半胱氨酸组 1 0 2.8 0±0.6 1＊ 1.3 3±0.2 5＊大补肾汤高剂量组 1 0 2.5 0±0.6 8＊ 1.2 5±0.3 6＊大补肾汤中剂量组 1 0 2.2 1±0.3 4＊ 0.9 4±0.3 3＊大补肾汤低剂量组 1 0 2.1 8±0.3 3＊ 0.8 6±0.1 9＊

2.3 大补肾汤对镉染毒大鼠肝组织SOD和MDA的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠SOD活力降低，MDA含量升高(P＜0.05)；与模型组比较，各给药干预组大鼠SOD活力均增加，MDA含量均降低(P＜0.05)，见表 3。

表3 各组大鼠肝组织SOD活性及MDA含量比较(±s)

表3 各组大鼠肝组织SOD活性及MDA含量比较(±s)

注：#表示与正常对照组比较，P＜0.05；＊表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 S O D/(U·m L-1) M D A/(n m o l·m L-1)正常对照组 1 0 1 3 1.0 9±1 1.9 8 2.9 8±0.4 7模型组 1 0 7 9.3 6±1 0.7 1# 5.2 9±0.4 2#乙酰半胱氨酸组 1 0 1 2 3.3 9±1 4.4 0＊ 3.2 5±0.2 8＊大补肾汤高剂量组 1 0 1 1 3.2 1±1 4.2 2＊ 3.3 1±0.5 0＊大补肾汤中剂量组 1 0 1 1 4.2 2±1 4.8 9＊ 3.9 3±0.4 7＊大补肾汤低剂量组 1 0 1 0 9.9 5±1 1.6 4＊ 4.5 9±0.3 6＊

2.4 大补肾汤对镉染毒大鼠肝组织细胞因子表达的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠IL-2含量降低，TGF-β1含量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，各给药干预组大鼠IL-2含量均增加，TGF-β1含量均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 各组大鼠肝组织IL-2和TGF-β1含量比较(±s)

表4 各组大鼠肝组织IL-2和TGF-β1含量比较(±s)

注：#表示与正常对照组比较，P＜0.05；＊表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 I L-2/(p g·m L-1)T G F-β 1/(n g·m L-1)正常对照组 1 0 1 7 0.8 3±1 0.2 1 5.1 1±0.5 9模型组 1 0 8 3.3 3±1 2.9 1#1 0.2 2±0.6 6#乙酰半胱氨酸组 1 0 1 5 1.3 9±1 4.3 5＊ 5.4 4±0.4 6＊大补肾汤高剂量组 1 0 1 4 8.8 1±1 4.7 7＊ 5.8 1±0.5 0＊大补肾汤中剂量组 1 0 1 4 0.1 8±1 3.6 9＊ 6.0 1±0.4 3＊大补肾汤低剂量组 1 0 1 3 4.7 1±1 2.2 7＊ 6.7 2±0.6 1＊

3 讨论

“大补肾汤”出自敦煌古医方，主要由地黄、竹叶、甘草、泽泻、桂枝、干姜、五味子组成，主治精气虚少，腰痛，骨萎，不可行走，虚热冲逆，头目眩，小便不利，脉软而快者方。大量研究证实，地黄复方制剂“地黄益智颗粒”[3]、地黄有效成分“地黄多糖”[4-5]、竹叶提取物[6]、甘草有效成分“甘草苷”[7]和泽泻[8]均可提高机体SOD活性，降低MDA含量，具有较好的抗氧化、提高免疫功能等生物学活性。本实验结果显示，模型组大鼠肝组织中SOD活性降低，MDA含量升高，可能是由于镉与SOD中的二价金属离子发生竞争性替代作用，抑制SOD活力有关[9]，也可能是镉进入体内产生的自由基不断消耗SOD，导致模型组SOD活性降低，MDA含量升高。大补肾汤干预后各剂量组大鼠肝组织中的SOD活性升高，MDA含量降低，提示大补肾汤能够增加氧自由基清除剂含量，抑制体内脂质过氧化过程，降低脂质过氧化产物含量和氧自由基代谢产物的损害，调节氧化/抗氧化系统平衡，从而使机体细胞和组织免受镉的损害。

胸腺与脾脏是机体重要的免疫器官，其结构正常与否直接影响机体的免疫功能，胸腺指数与脾脏指数的高低变化可以反映机体的免疫功能状态[10]。另外，IL-2 和 TGF-β1在免疫功能调节方面为一对截然相反的指标。IL-2是机体正向免疫调节中最重要的细胞因子之一，主要由T淋巴细胞分泌，其功能是促进 T、B 淋巴细胞的增殖[11]。TGF-β1可能是免疫系统关闭的信号之一，其可以抑制所有淋巴细胞的增殖与功能[11]。本实验结果表明，模型组大鼠胸、脾指数明显降低，肝组织IL-2含量降低，TGF-β1含量升高，提示镉染毒后，机体的免疫功能受损。大补肾汤干预后，各剂量组大鼠脾脏指数及IL-2含量增加，大补肾汤高剂量组大鼠胸腺指数增加，大补肾汤各剂量组大鼠TGF-β1含量降低。提示大补肾汤可能通过调节机体细胞因子表达，从而纠正和改善机体的免疫功能。

总之，镉中毒可以导致机体发生氧化应激损伤及免疫功能紊乱。大补肾汤可能通过提高机体的抗氧化能力，加速机体自由基的清除来纠正机体的氧化和抗氧化之间的平衡失调，也可能通过调节细胞因子的表达来纠正和改善机体的免疫功能，最终达到拮抗镉毒性的目的，从而对肝脏起到保护作用，但其具体机制尚需进一步研究。

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