黄丹化瘀饮对大鼠脑缺血再灌注损伤及脑组织BDNF、VEGF表达的影响

鲁利甫，邱雪银

（1.河南省濮阳市中医医院药剂科，濮阳 457000；2.河南省濮阳市人民医院肿瘤科，濮阳 457000）

缺血性脑血管疾病是因脑血管病变致使血流减少或中断，使血管供应区出现缺血缺氧情况，出现一些病理生理反应。缺血后最重要的代偿机制就是促进损伤区的血管再生，搭建良好的侧支循环。有研究证实[1-2]，血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）在重建缺血性脑血管病变的微循环中作用重大，是脑缺血后使血管再生的调控中心。脑源性神经生长因子（BDNF）在神经生长因子的家族中代表性最强，当神经元发生病变或损伤时，在神经元及其胶质细胞中会有BDNF大量表达，发挥支持、营养、再生等功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠，均为健康雄性，SPF级，体质量平均（224±16）g，动物合格证号为 SYXK（苏）2013-0018，由南京正大天晴公司提供。

1.1.2 药液 黄丹化瘀饮组方主要包括：黄芪、丹参、葛根、钩藤各30 g，川芎10 g，三七粉4.5 g。将中药饮片浸泡30 min（蒸馏水），用文火煎煮15 min，煎煮3次后，煎煮药液混合并过滤，过滤后的药液分别浓缩为浓度为100%、200%、400%的黄丹化瘀饮（生药含量分别 1、2、4 g/mL），储于冰箱（4℃）中备用。

1.1.3 试剂与仪器 兔抗鼠VEGF一抗、BDNF一抗、VEGFR-1抗体、鼠抗兔二抗试剂盒均由武汉博士德公司提供；蛋白定量试剂盒（BCA）；ECL显影液。自动脱水机，德国ASP200S；石蜡包埋机，德国EG1150H；冰箱，日本SANYO；图文分析系统，德国。

1.2 方法

1.2.1 分组 实验动物随机分为5组（每组12只）：假手术组、脑缺血再灌注模型组（模型组）、小剂量组[7.20 g/（kg·d）]、中剂量组[14.40 g/（kg·d）]、大剂量组[28.80 g/（kg·d）]。剂量根据大鼠与人体的剂量折算[3]。假手术组、模型组用等体积蒸馏水代替。各组均术前7 d开始给药（灌胃），每日1次，最后一次给药1 h后，制备脑缺血模型（大脑中动脉）。

1.2.2 大鼠模型制备 制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，用Liu F[4]改良线栓法。具体方法：大鼠仰卧位固定，麻醉大鼠（用10%水合氯醛，剂量350 mg/kg），经颈部正中切口将颈动脉三角暴露，分离左侧颈总动脉、颈内及颈外动脉，将颈总动脉及颈外动脉结扎，在颈外动脉接近分叉的地方剪“V”形切口，用钝性鱼线线栓（赖氨酸包被、直径0.26 mm）斜行插入，由颈内动脉推进入大脑中动脉，遇到有阻力时止（约插入18～20 mm）。然后肌肉、皮肤缝合，术中大鼠肛温（37.0±0.5）℃。假手术组不插线栓，其他组均此操作。

1.2.3 神经功能评分检测 根据神经功能缺损评分（ZeaLonga评分法）[4]（5分制）进行大鼠神经功能评分：无神经功能损伤的症状，为0分；对侧前爪无法完全伸展，为1分；向右侧转圈，为2分；向右侧倾倒，为3分；意识丧失、不能自发行走，为4分。评分为1～3分的大鼠入组实验。

1.2.4 脑梗死体积测定 大鼠脑缺血2 h后再灌注24 h，麻醉迅速取脑，速冻（-20℃）18 min后，将脑组织置入脑槽，随脑组织冠状面切成5片，并放入2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC)2%的溶液中，避光置入水浴箱中（37℃）30 min。然后脑片放入多聚甲醛溶液（4%）中固定4～6 h，用数码相机拍照，图像分析系统计算梗死面积。

1.2.5 组织学检查 在大鼠脑缺血2 h后进行再灌注，24 h后，水合氯醛（10%）麻醉，并迅速开胸，心脏用生理盐水冲洗，4%多聚甲醛灌注并固定，然后断头取脑，并置入同样灌注液，在4℃的条件下固定1周，脱水透明浸蜡、包埋，HE染色、封片，并观察（在光镜下）。

1.2.6 免疫组织化法 取大鼠脑组织切片，根据试剂盒说明书严格操作，双氧水（H2O2）（3%）室温孵育，兔抗鼠VEGF、BDNF、VEGFR-1一抗工作浓度均为1∶200，然后加二抗，蒸馏水冲洗，复染（苏木素）、分化（盐酸乙醇）、脱水（乙醇）、透明（二甲苯）、封片（中性树胶），显微镜下观察。

1.2.7 蛋白质印迹法（Western blot）检测 取缺血侧的大脑皮质，提取蛋白，BCA法对蛋白浓度进行测定。蛋白变性后，电泳（SDS-PAGE）、转膜并封闭，然后分别加入一抗（VEGF、BDNF、VEGFR-1均为1∶1 000；β-actin 为 1∶2 000），在 4 ℃下孵育过夜。羊抗兔二抗（1∶2 000，HRP 标记），室温孵育，增强化学发光法（ECL）显色，凝胶成像、显影。Western blot条带灰度值用Image J图像分析系统，结果为VEGF、BDNF、VEGFR-1和β-actin的灰度值之比表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0进行统计学处理，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用重复测量的单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能评分及梗死体积分析 模型组脑缺血再灌注24 h后脑梗死体积及神经功能评分与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组、大剂量组脑梗死体积及神经功能评分与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；小剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1，图1。

表1 各组神经功能评分及梗死体积分析（x±s）

2.2 各组脑缺血组织VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表达分析 模型组VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表达明显高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中剂量组、大剂量组VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表达明显高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；小剂量组与模型组比较，VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2，图2，图 3，图 4。

表2 各组脑缺血组织VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白表达分析（x±s）

3 讨论

图1 各组脑梗死再灌注24 h后TTC染色情况，深色为正常脑组织，浅色为梗死组织

图2 各组脑缺血组织VEGF蛋白表达（immunohistoche-mistry，×400）

图3 各组脑缺血组织BDNF蛋白表达（immunohistoche-mistry，×400）

图4 各组脑缺血组织VEGFR-1蛋白表达（immunohistoche-mistry，×400）

黄丹化瘀饮为本院多年总结出的治疗缺血性脑血管病的中药方剂，其由黄芪、丹参、钩藤、三七、川芎、葛根等草药组成，主要通过活血、益气、化瘀等发挥脑缺血损伤的治疗作用[5]。赵志敏等[6]现代药理证实，三七中的三七总皂苷能明显使缺血再灌注大鼠脑组织BDNF蛋白合成明显增加，上调BDNF mRNA的含量。丹参中的丹参酮ⅡA能明显降低局部脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积，也有研究证明其能够上调人CREB调节转录辅激活因子1（TORC1-CREB）信号通路，增强相关基因转录，上调某些神经营养因子的表达，调节神经元损伤后再生等[7-8]。本研究结果显示，黄丹化瘀饮中剂量、大剂量组大鼠神经功能评分、脑梗死面积均明显低于模型组，由此提示此汤剂的有效性。

本研究结果显示，模型组大鼠缺血再灌注损伤后，VEGF蛋白表达明显高于假手术组，这是机体对抗脑组织损伤自身保护的一种方式，与模型组比较，中剂量组及大剂量干预后，能明显上调BDNF、VEGF表达，从而发挥保护神经细胞的作用[9-10]。本研究结果还显示，中剂量组及大剂量干预后，使VEGFR-1表达也明显升高，这说明中、大剂量黄丹化瘀饮促进VEGF蛋白表达的同时，也能够上调其受体表达来促进缺血区的血管生成。此结果和刘秀萍[11]的研究不同，分析其原因，可能是因为研究缺血再灌注时间不同所致（本研究选取时间点为缺血2 h/再灌注24 h，刘秀萍[11]的研究选取时间点为缺血2 h/再灌注12 h，药物促进VEGFR-1表达作用可能还没有充分显现出来）。

黄丹化瘀饮用于脑缺血再灌注后脑损伤模型大鼠，能通过上调VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白水平发挥神经保护作用。不足的是，本研究是多种中药方剂，对具体药物的具体成分发挥的上调VEGF、BDNF、VEGFR-1蛋白水平的作用仍需进一步研究。

参考文献：

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[10]马建鹏.康脑液对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经血管因子、MMP-9、ERK1/2表达的影响[D].石家庄：河北北方学院，2015.

[11]刘秀萍，邓 方.银杏内酯和白果内脂对大鼠脑缺血再灌注损伤后VEGF的表达的影响[J].中风与神经疾病杂志，2015,32(2)：108-110.