体外受精生产性控犏牛胚胎条件的优化

王 森，孙永刚，李瑞哲，马志杰，陈生梅，徐惊涛(青海大学 畜牧兽医科学院，青海 西宁810016)

牦牛是生活在海拔2 500～5 000 m青藏高原地区及毗邻高山亚高山地区的一种特有畜种，青藏高原牧民赖以生存的主要生活资料和生产资料。牦牛在外形和生理性能上都与其他牛种有所不同，生产性能较低，繁殖季节明显，繁殖性能低[1]。对比牦牛和黄牛卵巢发现，牦牛卵巢的大小、卵泡数量及卵泡大小均显著低于黄牛[2]。犏牛是牦牛和普通牛种的杂交后代，其肉质鲜嫩，产肉和产奶丰富。当地黄牛和牦牛混群交配是传统的生产犏牛的方法，因个体差异、生活习性及高寒气候适应性影响，混群交配的效果并不理想。真犏牛为雄性黄牛和雌性牦牛的杂交后代，出生体格大，容易造成难产，公犏牛雄性不育，无法使杂交优势延续[3]。

孙永刚等[4]利用体外受精技术繁育犏牛并取得一定的成果，犏牛体外受精的囊胚率可以达到41.23%。自从Johnson等[5]利用流式细胞仪分离家兔精液，并通过输卵管输精得到成活后代以来，先后在牛[6]、猪[7]、羊[8]、猫等[9]家畜身上得到应用。而犏牛胚胎生产技术方面的研究较少，性控犏牛胚胎生产技术至今还没有相关研究报道。因此，本研究对性控犏牛胚胎的生产条件进行探索，优化性控犏牛胚胎的生产条件，提高性控犏牛胚胎的囊胚率，以期解决青藏高原牧区犏牛生产的瓶颈，为优良犏牛生产、推广提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 性控精液

性控冻精精液购自上海奶牛育种中心有限公司(冻精编号：XK31108526)。

1.2 主要试剂、操作液、培养液

TCM-199、FBS(胎牛血清)购自Gibco公司，Percoll试剂购自Solarbio公司，其他试剂没有说明均为Sigma公司。倒置显微镜(Olympus IX71)，体视显微镜(Olympus SZX16)，CO2培养箱(Heal Force HF90和BINDER)。

1.2.1 体外成熟液配制 PBS：6.66 mg/mL NaCl+0.24 mg/mL KCl+0.168 mg NaHCO3+56 μg/mL NaH2PO4·H2O+0.14%乳酸钠+2 mM CaCl2·2H2O+0.5 mM MgCl2·6H2O+2.4 mg/mL Hepes+1.5 mg/mL BSA+0.2 mM C3H3NaO3。调pH7.2～7.4之间，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存。卵母细胞成熟液：TCM-199+10% FBS+0.2 U/mL FSH+0.2 mM C3H3NaO3+0.0037 mg/L β-雌二醇。

1.2.2 洗精液、受精液的配制 基础BO-working液：0.66 mg/mL NaCl+0.03 mg/mL KCl+0.02 mM CaCl2·2H2O+ 0.005 mM MgCl2·6H2O+0.113 mg/mL NaH2PO4·H2O +0.31g/mL NaHCO3+1.25 mM C3H3NaO3+50 mg/mL庆大霉素+13.9 mM Glucose。精子洗涤液：90%Percoll分离液：90 mL Percoll+10 mL BO-working+0.037 M NaHCO3;45%Percoll分离液：1 mL 90%Percoll+100 mM C3H3NaO3+0.25 g/mL Glucose+1 mL BO-working。精子获能液：CR1aa+3.1 mg/mL咖啡因。受精液： CR1aa+4 IU/mL肝素钠。调节pH 7.2～7.4至之间，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存。

1.2.3 胚胎培养液CR1aa的配制 CR1aa：6.7 mg/mL NaCl+0.23 mg /mL KCl+2.2 mg/mL NaHCO3+0.04 mg/mL C3H3NaO3+0.54 mg/mL半乳酸钙+0.15 mg/mL L-glutamine+0.01%非必需氨基酸+0.02%必需氨基酸。0.3%BSA CR1aa：150 mg BSA+50 mL CR1aa。5%FBS CR1aa：2.5% FBS+47.5 mL CR1aa。以上溶液滴入少许酚红指示剂，调节pH至7.2～7.4之间，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存。所有试剂在使用之前需在细胞培养箱里平衡2 h以上。

1.3 试验方法

1.3.1 卵母细胞的体外成熟 牦牛卵巢来源于青海省西宁市屠宰场。屠宰后的牦牛尽快采集卵巢，放置于22～26 ℃的灭菌生理盐水(含200 IU/mL青霉素和200 IU/mL链霉素)的保温瓶中，4 h内带回实验室，保持卵巢保存温度在20 ℃左右，用眼科手术剪剪去卵巢周围的附属组织，用灭菌的生理盐水清洗卵巢3次，用带有7号针头的一次性注射器抽取卵巢表面2～8 mm卵泡内卵泡液，放置于灭菌培养皿中，在实体显微镜下用捡卵针捡取卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，选取透明带完整，周围的颗粒细胞包裹紧密的COCs，在PBS缓冲液里面清洗2遍，转移到成熟液里清洗一遍后放入成熟液里面，在38.5 ℃、5%的饱和湿度下培养24 h。

1.3.2 精子的解冻与获能 从液氮罐中取一支冷冻性控精液，迅速投于38 ℃左右的温水中，解冻30 s，用75%的酒精棉球擦拭冻精管，将冻精管中的精液加入含有Percoll分离液的离心管中，2 000 rpm/min，20 min弃上清，加入4 mL含有咖啡因的CR1aa液，1 500 rpm/min，5 min，弃上清，留大约有200 μL；取5 μL的精液，加入495 μL受精液混匀，吸取10 μL左右的混合物，滴入血球细胞计数板中，进行精子计数。悬浮精子并调整精子浓度。

1.3.3 卵母细胞体外受精 分别制成50 μL受精微滴，用石蜡油覆盖。将体外成熟的卵母细胞用吸卵针吸出，放置于含有BSA的CR1aa液中清洗两遍。每个受精微滴中加入50 μL的精液，放置于饱和湿度的CO2培养箱中受精6～28 h。

1.3.4 受精卵的体外培养 将受精完成的卵母细胞吸出，放在透明质酸酶中反复吹打去除颗粒细胞。在清洗液中清洗2遍，转移到含0.3% BSA的CR1aa微滴中培养，第2 d统计卵裂率。

1.3.5 牦牛卵丘细胞共培养 制作50 μL的5% FBS CR1aa微滴，用石蜡油覆盖。在饱和湿度的CO2培养箱中平衡2 h以上。将牦牛的卵泡液经过离心后，吸取沉淀，用5%FBS CR1aa溶液清洗一遍后，将沉淀悬浮，取50 μL加入到5% FBS CR1aa微滴中培养，每2 d半数换液。将受精后去除卵丘细胞的受精卵放入卵丘细胞微滴中进行培养，第7～8天统计囊胚率。

1.3.6 牦牛输卵管上皮细胞共培养 在屠宰场里，选取卵巢上带有黄体的刚屠宰后牦牛的输卵管，放入自封带中以防污染，25 ℃，4 h运回实验室，用PBS反复冲洗。用手术剪将牦牛输卵管剪下，用盖玻片从牦牛子宫向卵巢方向刮取输卵管上皮细胞，用含有10%FBS+TCM-199的溶液离心清洗后，重悬。加入到含有5 mL的10%FBS+TCM-199溶液的灭菌细胞培养瓶中，培养2 d。将贴壁的细胞吹打成悬液，加入到培养微滴中，培养2 d。每隔2 d半数换液。将受精后去除卵丘细胞的受精卵放入输卵管上皮细胞微滴中培养，第7～8天统计囊胚率。

1.4 数据分析

数据的结果以平均数±标准差(Mean±SD)的形式表示。采用SAS软件的ANOVA程序对数据进行分析，P<0.05为差异显著。每个处理组至少重复3次以上。

2 结果与分析

2.1 受精时间对性控犏牛胚胎发育的影响

从表1知，体外受精24 h的卵裂率均高于受精6 h和18 h(P<0.05)。体外受精24 h囊胚率显著高于受精6 h、18 h和受精28 h(P<0.05)。

2.2 性控精液的浓度对性控犏牛胚胎发育的影响

由表2知，当性控精液的浓度为4×106～6×106个/mL时，其卵裂率显著高于浓度为0.4×106～0.6×106个/mL和浓度为0.04×106～0.06×106个/mL(P<0.05)。4×106～6×106个/mL和0.4×106～0.6×106个/mL的精液浓度受精后的囊胚率差异不显著(P>0.05)，但均显著高于0.04×106～0.06×106个/mL的囊胚率(P<0.05)。

表1 受精时间对生产性控犏牛胚胎的影响Table 1 Effect of fertilization time on efficiency of sexed embryos

注:同列肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著 (P>0.05)。下同。

Note: Values with different superscripts in the same row mean significant difference between the treatments(P<0.05), the same superscripts mean insignificant difference (P>0.05). The same blow.

表2 性控精液的浓度对生产性控犏牛胚胎的影响Table 2 Effect of sperm concentration on efficiency of sexed embryos

2.3 成熟后COCs的卵丘细胞脱除程度对性控犏牛胚胎发育的影响

成熟后COCs的卵丘细胞脱除程度对生产性控犏牛胚胎(黄牛♂×牦牛♀)的影响见表3。由表3知，卵丘细胞不脱除的卵裂率和完全脱除组均显著高于半脱除组(P<0.05)。而不脱除组的囊胚率显著高于半脱除组和完全脱除组的囊胚率(P<0.05)。

2.4 不同胚胎培养液对性控犏牛胚胎发育的影响

从表4知，三种培养体系的卵裂率差异不显著(P<0.05)，输卵管上皮细胞共培养的囊胚率和卵丘细胞共培养的囊胚率显著高于FBS CR1aa培养液(P<0.05)，输卵管上皮细胞共培养的孵化囊胚率显著高于其他两组(P<0.05)。

表3 成熟后COCs的卵丘细胞脱除程度对生产性控犏牛胚胎的影响Table 3 Effect of the degree of cumulus removal on efficiency of sexed embryos

表4 不同的胚胎培养液对性控犏牛胚胎发育的影响Table 4 Effect of embryo culture fluid on efficiency of sexed embryos

2.5 胚胎培养环境对性控犏牛胚胎发育的影响

牦牛卵母细胞成熟后，对卵丘细胞分别采取卵丘细胞不脱除进行体外受精，性控精液浓度为4×106～6×106个/mL、体外受精24 h，进行卵丘细胞共培养分别放在低氧(5% CO2、5% O2、90% N2)和高氧(5% CO2)的环境中培养。从表5知，在低氧环境下胚胎的卵裂率和囊胚率均显著高于高氧环境的卵裂率和囊胚率(P<0.05)，但孵化囊胚率差异不显著(P>0.05)。

表5 胚胎培养环境对性控犏牛胚胎发育的影响Table 5 Effect of embryo culture environment on efficiency of sexed embryos %

3 讨 论

哺乳动物的卵母细胞是经过减数分裂的单倍体细胞，分化程度高。一般在体外受精过程中，将分离得到的COCs在体外成熟培养液中成熟培养一段时间，观察出有第一极体排出，判定为成熟。卵母细胞成熟后，外围颗粒细胞会发生膨大，通常也将周围颗粒细胞膨大作为卵母细胞成熟的标志[10]。卵母细胞质量与成熟的好坏直接关系着随后IVF和胚胎发育的能力。研究发现，牦牛的卵母细胞能与黄牛精子进行体外受精，但囊胚的发育率极低[11]。Zi等[12]用黄牛的卵母细胞与牦牛精子进行种间体外受精时发现，所生产的犏牛胚胎囊胚率比纯牦牛囊胚率高，在体外受精水平上表现出了一定的杂种优势。本研究中，牦牛卵母细胞与奶牛性控精子进行种间体外受精时，卵裂率较高，但囊胚率发育水平较低。性控精液经分流处理后，精子会受到物理或化学损伤。

研究发现，用BO液作为基础受精液，可以在很短的时间内完成受精。但Rehman等[13]用SOF液作为受精液时，受精时间延长至18～24 h，可以得到很好的受精效果。Barcelo-Fimbres等[14]发现，受精18 h的卵裂率和囊胚率均高于4 h，由此说明如果受精时间过短则会导致受精不充分，从而影响体外受精胚胎生产效率。本研究用CR1aa作为受精液，发现受精24 h的性控犏牛胚胎的卵裂率和囊胚率均显著高于其他组，受精18 h的性控胚胎卵裂率和囊胚率与受精6 h差异并不显著。

体外受精过程中，性控精液浓度的大小对性控胚胎的卵裂率和囊胚率有着至关重要的作用。Lu等[15]表示，较高浓度的性控精子在体外受精过程中能够提高囊胚率，所以体外受精时需要一定数量的精子。但是也有研究发现，精子浓度过高会引起多精入卵，影响后期胚胎发育[14]。许保增[11]研究发现，牦牛卵母细胞与普通黄牛精子进行种间杂交时，精子浓度为0.4×106～0.6×106个/mL的卵裂率显著低于精子浓度为4×106～6×106个/mL，而囊胚率差异不显著，与本研究中性控精液的IVF的结果相一致。性控精液经过了流式分离法，暴露的时间较长，对精子活力有很大的影响，况且市面上性控冻精管比普通冻精的价格贵10～15倍。所以在性控犏牛胚胎生产时，将性控精液的终浓度调整在0.4×106～0.6×106个/mL也可达到预期效果。

颗粒细胞是一种黏液状的细胞外基质蛋白，经过促性腺激素的刺激诱导产生。细胞外基质一个重要成分是透明质酸(hyaluronic acid, HA)，能促进卵母细胞成熟和受精[16]。吴冬升等[17]研究发现，体外受精过程中性控精子的活力下降比常规精子快很多。赵学明等[18]在研究影响奶牛性控胚胎的因素时，发现卵丘细胞部分脱除组的卵裂率显著高于不脱除组和完全脱除组，而囊胚率差异不显著。本研究发现，半脱除组的卵裂率(51.50%)和囊胚率(13.77%)均显著低于其他对照组。由此说明，在牦牛卵母细胞种间受精过程中，卵丘细胞对精子受精有着吸引和选择性控精子的作用。

卵泡中卵母细胞和体细胞之间的交流是复杂的过程，是通过多种信号传导的[19]。母体内输卵管是精子运动、获能、受精的主要场所，也是卵母细胞运输、成熟和早期胚胎发育的场所[20]。共培养体系能够提高囊胚发生率，克服牛受精胚8～16细胞的发育阻滞，使之能够发育成早期囊胚[21]。通常情况下，把囊胚形成率作为胚胎早期发育能力的一个重要指标。孙永刚等[4]研究发现，牦牛卵母细胞种间杂交产生的受精卵，在后期培养的过程中，卵丘细胞共培养与输卵管细胞共培养受精卵的卵裂率和囊胚率差异不显著，但是均显著高于SOF培养液。本研究发现在性控犏牛胚胎发育过程中，卵丘细胞共培养的卵裂率和囊胚率与输卵管上皮细胞共培养无显著性差异，两者胚胎发育水平均显著高于CR1aa培养液，与以上结果较一致。本研究发现，输卵管上皮细胞共培养的孵化囊胚率较高，性控精子的活力较低，并且在受精过程中活力下降较快，因此采用输卵管上皮细胞共培养较适合性控犏牛胚胎的培养。

传统的单气培养箱，氧分压的浓度是20%，而高浓度氧可以增加活性氧的产生，使胚胎引起氧化应激，不利于胚胎的生长，这些研究已在牛上得到验证[22]。Petersen等[23]发现，通过不同氧浓度下生长的人卵裂胚胎，冷冻解冻后低氧环境下卵裂胚的囊胚形成率高。本研究发现，在低氧环境下犏牛胚胎的卵裂率(71.98%)和囊胚率(23.42%)均显著高于高氧环境的卵裂率(58.13%)和囊胚率(11.83%)，与以上结论相一致。

4 结 论

本研究结果表明，体外生产性控犏牛胚胎的最佳条件是体外受精24 h，性控精液浓度为0.4×106～0.6×106个/mL，采取卵丘细胞不脱除方法，胚胎培养方式最好采用输卵管上皮细胞共培养，胚胎培养环境采用低氧环境。

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