微生物疫苗在1型糖尿病中的应用

贺冬梅，尤 琪，吴 洁

（中国药科大学生命科学与技术学院酶工程实验室，南京210009）

1型糖尿病（type 1 diabetesmellitus，T1DM）是一种常见的青少年儿童自身免疫性疾病，由于机体异常导致胰岛β细胞受到自身反应性T细胞介导的免疫攻击，使其丧失合成和分泌胰岛素的功能，引发代谢失控和血糖水平升高［1］。T1DM患者表现为高血糖，多尿、多饮、多食，体重减轻等症状，相关抗体检测阳性率高，如胰岛素自身抗体（IAA）、谷氨酸脱羧酶抗体（GADA）等［2］。血糖若长期失控，会引发心脑血管、肾、眼、神经等部位的病变［3］。截至目前为止，还没有根治该疾病的方法，故一旦发病，患者需终生注射胰岛素进行控制，给患者带来极大的不便和痛苦。

非特异性免疫抑制剂（如环磷酰胺、硫唑嘌呤和环孢菌素A等）可以在一定程度上抑制免疫系统，控制胰岛炎症，减少β细胞的免疫破坏及凋亡，从而延缓T1DM的发展。然而长时间、大剂量的治疗产生的不良反应过大，限制了其在临床的应用［4］。抗原特异性免疫治疗即通过识别胰岛特异性抗原，诱导机体对胰岛抗原产生免疫耐受且不会造成全身性免疫失调。抗原特异性治疗可有效延缓动物模型胰岛β细胞的进一步损伤，保护残存的胰岛功能，但临床治疗效果并不显著。除此之外，当这些抗原被自身抗体识别后，可能会加速T细胞对胰岛β细胞的破坏［5］。

非肥胖性糖尿病小鼠（non-obese diabetic，NOD）是一种被广泛应用的自身免疫性糖尿病模型，在无特定病原体和无菌环境中都可自发形成糖尿病，但在无菌环境中T1DM的发病时间显著加快［6］。多项研究表明，新生儿的外部环境如分娩方式、喂养成分、宠物接触［7］以及抗生素的使用［8］都会影响T1DM，而且通过改变饮食、调整肠道菌群［9］以及增加微生物的接触［10］都能够预防和延缓T1DM的发病。还有研究发现，BBdp大鼠、NOD小鼠以及T1DM患者的肠道菌群多样性显著降低，且易引发炎症的细菌数量增加［11］。除此之外，寄生虫和共生微生物与人类的免疫系统共同进化，这些微生物对促进正常的免疫发育至关重要［12］。卫生学假说也支持微生物是推动机体免疫系统建立的重要因素的说法，认为发达国家T1DM和过敏症等青少年自身免疫性疾病的发病率居高不下，与幼年时期机体免疫系统缺少与环境微生物的接触有关［13］。因此，利用微生物及其有效成分来诱导免疫系统耐受的建立，减少免疫系统的敏感性，有望在早期延缓或阻断自身免疫反应，减少胰岛β细胞的损伤。

随着对T1DM发病机制的不断深入研究，微生物与宿主免疫调节之间的相互关系受到越来越多的关注，亦为T1DM的预防和治疗带来了新的思路和突破。已有多篇文献报道微生物疫苗的科学性和安全性，如微生物提取物OM-85广泛应用于儿童呼吸道感染多年。除此之外，T1DM微生物疫苗在动物模型上取得了较好的结果，甚至有一些疫苗已经进入临床试验，如卡介苗（BCG）。本文对国内外相关1型糖尿病微生物疫苗的研究进行综述，对不同疫苗可能的作用机制进行讨论，以期为预防和治疗T1MD的临床研究提供参考。

1 微生物灭活疫苗

弗氏完全佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）主要包含灭活的结核分枝杆菌，能够有效地诱导机体产生高滴度的抗体。佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，能长期刺激局部免疫反应。研究表明，NOD小鼠在注射CFA后，发病率显著下降，胰岛β细胞的损伤和胰岛炎症明显减轻［14］。有报道证明，CFA是通过干扰素-γ（IFN-γ）来调节CD4＋CD25＋Treg细胞和致病性T细胞之间的平衡，从而维持自身免疫平衡，阻止1型糖尿病的发生［15］。而早期发现，CFA免疫可减少针对胰岛β细胞的特异性自身反应性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的产生，同时使 FasL／Fas凋亡通路受限，减少β细胞的凋亡。除此之外，CFA还抑制CD8＋T细胞在胰岛局部的聚集，从而对胰岛局部β细胞起到免疫保护作用，但自然杀伤T淋巴细胞（NKT）却有所增加［16］。因此，完全揭示CFA预防T1DM的作用机制仍需要更深入的研究。虽然CFA是一种高效的刺激剂，但会引起机体产生过度的免疫应答导致皮肤坏死等，因而限制了CFA的临床使用。

Q热补体结合抗原（QFA）来源于灭活的贝氏柯克斯体，QFA疫苗可引起长期的免疫应答来应对Q热病原体，并对其他传染性病原体产生有效的非特异性抑制作用，包括疟原虫和细菌病毒。这种非特异性的作用有可能与肿瘤坏死因子（TNF）、IFN-γ以及一氧化氮（NO）暂时性升高有关，而这些因素都参与细胞介导的免疫应答［17］。研究证明，9～10周的雌性NOD幼鼠腹腔注射QFA，可有效减轻胰岛损伤，保护胰岛β细胞，阻止NOD小鼠糖尿病的发展。但QFA疫苗对IFN-γ缺失的NOD小鼠无效，说明QFA是通过诱导IFN-γ产生，起到预防 T1DM发生的作用［18］。同时，IFN-γ是诱导NO产生的重要物质，且NO可阻止自身免疫性疾病如自身免疫性脑脊髓炎的发生［19］。因此，QFA疫苗的保护效应可能是通过NO调节机制来实现的。

2 微生物减毒活疫苗

BCG的主要成分是结核分枝杆菌的减毒株，作为一种预防儿童肺结核的疫苗，BCG早在1921年就应用于人类［20］。目前，BCG作为1型糖尿病疫苗已经进入临床2期试验，1期临床结果表示，长期1型糖尿病患者经多次注射BCG疫苗，胰岛素分泌功能出现轻微、暂时性的恢复（NCT00607230）。BCG疫苗可暂时性地升高TNF，且可以选择性地消除攻击胰岛的T细胞，促进胰岛细胞再生。其作用机制目前尚不清楚，有推测是与CFA和QFA疫苗机制一致，这些外来抗原接种后，激活了体内的Treg，这种调节性T细胞具有抑制自身反应性T细胞的功能，转移至胰岛内部后，释放抑制性细胞因子如白介素4（IL-4）和IL-10等引出对自身抗原的耐受信号，促使T细胞向Th2细胞分化，并抑制Th1细胞及其细胞因子包括IFN-γ、IL-2、TNF的产生从而阻止了细胞毒性T细胞对胰岛β细胞的破坏和糖尿病的发生［21］。

寄生虫感染NOD小鼠后能下调小鼠自身免疫性T细胞的产生，稳定Th1／Th2细胞之间的平衡，增加抗炎因子中转化生长因子-β（TGF-β）和IL-10的表达，保护胰岛β细胞不受Th1细胞介导的自身免疫性损伤，从而阻止T1DM的发生［22］。寄生虫感染还能使胰腺内的CD4＋T细胞水平升高，CD8＋T细胞和NK细胞的水平下降［23］。链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠模型在感染肥头绦虫后，能调节血糖，缓解模型小鼠高血糖症状。但研究发现绦虫感染没有上调Treg细胞的产生，而是增加了巨噬细胞表面细胞程序性死亡受体配体1（PDL-1）的表达［24］。除此之外，寄生虫治疗已在多种自身免疫性疾病治疗中展开临床试验，结果表明无明显不良反应，这为寄生虫疫苗在T1DM的研究中打下坚实的基础［25］。

此外，病毒也可以预防糖尿病的发生。众多研究表明，人类肠道病毒如柯萨奇病毒（CVB）感染与T1D的发生密切相关。幼年雌性NOD小鼠注射低剂量柯萨奇病毒B3减毒株（CVB3）后，形成糖尿病抵抗模型，这些模型可延缓T1DM的发生，改善胰岛损伤，并降低其发病率［26］。Filippi等［27］认为，病毒感染延迟T1DM发病的可能机制是暂时性上调淋巴细胞的PDL-1表达而引起的免疫抑制，因为活化的T细胞和NK细胞等表达的细胞程序性死亡受体1（PD-1）与PDL-1结合后作为共刺激信号对T细胞免疫起到负调节作用。而病毒感染可减少T1DM的发病率则可能是通过增加Treg细胞来调节免疫平衡。但人类肠道病毒B组病毒却可以加速胰岛炎和β细胞凋亡［28］，说明病毒株的类型和剂量的选择是病毒疫苗应用的关键。

3 微生物亚单位疫苗

尽管多项数据表明，失活和减毒的微生物疫苗在动物实验中能有效阻止1型糖尿病的发展，但其仍然存在未知的不良反应，所以发现并分离微生物的有效成分将成为一个更安全的途径。

大肠埃希菌热不稳定肠毒素（LT）是一种黏膜免疫原和黏膜免疫佐剂，LT由A和B亚单位两个部分组成。A亚单位具有ADP核糖基转移酶活性，B亚单位（LTB）是LT的受体结合亚单位。LTB可以通过促进Treg细胞的增殖发挥免疫抑制效应，同时上调细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的表达，而CTLA-4则可通过与共刺激分子B7协调作用，使T细胞的活化受到限制。除此之外，LTB还可以通过某种机制促进不成熟DC细胞（iDC）的大量产生，抑制T细胞的活化来诱导免疫耐受，改善自身免疫性疾病的免疫攻击［29］。早期研究发现LTB可以缓解治疗组NOD小鼠的胰岛炎症，增加IL-10的分泌，同时还可减少巨噬细胞、CD4＋T细胞、B细胞以及组织相容性复合体2（MHC-II）在胰腺的聚集。这些结果显示LTB的早期干预可有效阻止NOD小鼠糖尿病的发展，但NOD小鼠年龄大于10周后，LTB免疫治疗无法达到预防效果［30］。

OM-85是由革兰阴性菌和革兰阳性菌的提取物组成，广泛用于治疗儿童反复性上呼吸道感染，具有较高的安全性［31］。Alyanakian等［32］证实，口服OM-85可以延迟NOD小鼠的发病时间，而腹腔注射OM-85则可以阻止小鼠T1DM的发生。重要的是，NOD小鼠在3～6周龄开始接受OM-85治疗，效果最佳。由于口服胰岛素的生物利用度较低，所以很难发挥其疗效，但有实验将大肠埃希菌提取蛋白OM-89与胰岛素共同灌胃后，显著降低了NOD小鼠的发病率，且降低胰岛部位的IL-4以及 NO合成酶（iNOS）的分泌［33］，但微生物提取物OM-85和OM-89成分复杂，还需要进行更多试验和评估。

脂多糖（LPS）是革兰阴性菌细胞壁中的一种成分，是激活巨噬细胞、中性粒细胞等的重要因素。多篇文献报道，NOD小鼠于早期尾静脉和腹腔注射LPS可以延缓糖尿病的发生以及减少发病率［34］。Caramalho等［35］也发现，4周龄、6～8周龄以及12周龄的NOD小鼠在连续多次腹腔注射LPS后，显著性的降低了小鼠T1DM的发生。即使在小鼠胰岛发生单核细胞浸润后进行给药，同样可以阻止糖尿病的发展。而LPS的保护机制被证明与增加Treg细胞的产生，减少Th1炎性细胞因子的合成，诱导免疫耐受有关。但最主要的是多次注射LPS疫苗能引发DC细胞的亚基低表达Toll样受体 4（TLR4），以及下调 TLR4及其下游的MyD88x信号通路，减少炎性细胞因子的释放［36］。这些数据说明，早期进行LPS干预能有效预防糖尿病的发生。

链球菌制剂OK-432作为免疫刺激剂，可激活巨噬细胞和杀伤性T细胞。已有实验证明，腹腔注射OK-432可保护胰岛细胞，有效阻止NOD小鼠和BBdp大鼠自发形成T1DM［37］。低剂量的环磷酰胺具有免疫增强作用，会加速自身免疫介导的胰岛B细胞的破坏，从而促进NOD小鼠自发性糖尿病的过程，但OK-432治疗后的小鼠却不受环磷酰胺的影响［38］。

4 微生物核酸疫苗

TLR家族成员在免疫细胞表面表达，能识别保守的微生物结构，如LPS、病毒DNA和RNA等，并且能够激活下游信号通路，引起机体的免疫应答，在微生物诱导免疫耐受的过程中扮演重要的角色［39］。将含有CpG基序的无蛋白编码的DNA质粒注射到NOD小鼠体内时，可以减轻小鼠胰岛炎症，减少T细胞的增殖，阻止针对胰岛抗原的免疫反应以及糖尿病的发展。体外实验中，CpG寡核苷酸可以诱导NOD小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-10［40］。但 Lee等［41］却表示，接种含有细菌 CpG序列的DNA疫苗对小鼠的糖尿病没有起到预防作用，所以细菌DNA疫苗在改善糖尿病过程中的试验方案和作用机制还有待明确。

5 微生物活载体疫苗

减毒活沙门氏菌联合前胰岛素原和TGF-β的疫苗在NOD小鼠8周龄时，持续给药3周，可以安全有效地减轻NOD小鼠的胰岛炎症，保护胰岛素分泌细胞并阻止糖尿病的发展。结果显示，联合疫苗免疫后可以提高NOD小鼠IL-10和IL-2的水平，但对促炎因子 IL-6，IL-12和 IFN-γ等没有影响［42］。

Duan等［43］将益生菌酸奶中发现的加氏乳杆菌与能产生胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的人类基因组合成重组菌进行口服灌胃。与对照组相比，STZ诱导的T1DM小鼠在口服重组菌90 d后，小肠和胰腺中的总胰岛素水平提高60%，血糖水平降30%。且该重组菌能诱导肠道细胞变成胰岛素分泌细胞，从而达到治疗效果［43］。

乳酸菌作为一种降血糖的生物效应调节剂，几乎无不良反应，且作用温和、性质稳定、效果明显而持久，对有效防治糖尿病具有十分重要的现实意义，已经成为近年来的研究热点。将T1DM的自身抗原GAD65与抗炎因子IL-10和anti-CD3共同导入乳酸菌重组成新型疫苗，这种疫苗能有效缓解新发T1DM小鼠的胰岛炎症，保护剩余胰岛β细胞，并恢复其机体血糖水平。与此同时，乳酸菌重组疫苗还能通过增加Treg细胞的表达来调节免疫平衡，减少胰岛的自身免疫性攻击［44］。

6 微生物疫苗预防T1DM的可能作用机制

微生物疫苗阻止T1DM发展的具体机制尚不清楚，但很多发现可以解释这种预防作用（如图1所示）。微生物疫苗在接种后，激活了体内的Treg细胞，释放抑制性细胞因子如IL-4、IL-10等引出对自身抗原的耐受信号。除此之外，微生物成分还能促使宿主的T细胞向Th2细胞分化，抑制Th1细胞的分化，从而阻止了Th1细胞对胰岛β细胞的破坏，最终改善了胰岛炎及T1DM。由于胰岛β细胞的异常凋亡和清理，导致大量自身抗原的暴露，最终导致胰岛损伤。而小鼠注射CFA后，可减少针对胰岛β细胞的特异性自身反应性CTL的产生，使FasL／Fas凋亡通路受限，从而减少β细胞的凋亡［45－46］。DC细胞是体内最主要的专职抗原呈递细胞，成熟的DC细胞能将信号传递给效应T细胞从而介导免疫反应。而LT疫苗却能诱导机体产生大量的不成熟DC细胞，从而使T细胞无法正常激活。LT疫苗使T细胞无应答的机制还包括上调CTLA-4的表达［47］。微生物疫苗的抑制机制还可能与下调巨噬细胞表面的免疫受体有关，如TLR。有研究表明，T1DM患者和小鼠模型体内都存在TLR4信号通路异常情况［48］，然而LPS多次注射后会导致小鼠体内的巨噬细胞低表达TLR4，导致TLR4及其下游通路表达的炎性因子 TNF-α和IFN-β等降低。正常情况下，PD-1通过与其配体PDL-1发挥免疫调控作用，而PDL-1基因敲除以及PD-1／PDL-1途径被抑制时，NOD小鼠出现更强烈的T细胞免疫应答［49］。而病毒感染能上调APC细胞的PDL-1表达，从而对T细胞免疫进行负调节，从而保护胰岛细胞。

图1 微生物疫苗预防T1DM的可能作用机制（表示促进表示抑制表示分泌表示损伤）

7 展 望

胰岛β细胞损伤至T1DM的发生是一个不可逆的过程，因此在胰岛炎症发生早期阻止机体免疫系统对β细胞的损伤成为T1DM预防研究的重点。虽然多种免疫抑制剂取得了较好的临床效果，却无法避免随之而来的药物毒性和对免疫系统的破坏。本文介绍了几种具有较大开发潜能的微生物疫苗种类，这些疫苗通过对机体进行早期免疫刺激，进而诱导自身免疫耐受，阻止效应T细胞对胰岛β细胞的攻击，为微生物疫苗在T1DM预防的临床应用中提供了新的思路和理论基础。但目前这些微生物疫苗离获得临床实质性应用仍然存在一定距离，今后还需要进一步了解各种微生物疫苗主要的作用成分及其具体作用机制，改善微生物有效成分分离纯化的方法和效率以及探究这些疫苗的临床使用标准。同时，如何区分保护性微生物刺激也是疫苗研究中值得探讨的问题。

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