固定化单宁酶澄清茶汤工艺条件的研究

饶建平

(福建省饮料用植物提取加工企业重点实验室/大闽食品(漳州)有限公司，福建 漳州 363000)

茶叶具有降血压、降血脂、降血糖、抗癌、抗氧化、抗衰老、抗病毒等多种保健功效[1-2]，是世界三大饮料之一，已成为全球最受欢迎的饮品，各种纯茶及名优茶饮料的需求量不断增大。而冷后浑一直是茶饮料工业化(速溶茶、茶浓缩液等)生产中的一个难题，犹待解决。冷后浑，又名茶乳酪，是指茶汤冷却后产生的浑浊现象，形成于茶饮料、速溶茶、茶浓缩汁的加工或贮藏过程中，进一步促使茶汤沉淀的发生和风味品质的下降。研究表明，茶汤沉淀(茶乳酪)是由多种化学成分通过氢键、结合键或疏水作用等络合产生的，主要作用成分为茶多酚、咖啡碱、蛋白质和金属离子[3-5]，其解决措施主要有物理沉降法、碱转溶、酶调控法等[6-7]。然而，这些方法都有一定的弊端，或改变茶汁原有的风味，或生产成本偏高。

酶调控技术可视为茶汤沉淀解决的常用措施。单宁酶能切断单宁中的酯键，释放的没食子酸阴离子能竞争咖啡碱，形成分子量较小的水溶性物质，使茶汤的澄清度增加，改善速溶茶的品质[8-10]。而价格昂贵、使用寿命短则成为限制单宁酶在茶汤沉淀中应用的瓶颈，固定化酶技术可有效的解决这一瓶颈。本文以高品质绿茶(龙井)为原料，采用固定化单宁酶对茶汤进行酶解澄清研究，采用正交试验对固定化单宁酶澄清茶汤工艺条件进行优化，以期找到最优的固定化单宁酶澄清茶汤工艺条件，为固定化单宁酶在茶饮料工业化生产的进一步应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

单宁酶：奎斯特公司；绿茶(龙井)：浙江三明茶叶有限公司；壳聚糖：济南海得贝海洋生物工程有限公司；单宁、乙醇、氢氧化钠、硫酸铵、盐酸、柠檬酸、戊二醛均为分析纯。

1.2 仪器与设备

752型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；Centrifuge TDL-5型离心机：上海安亭科学仪器厂；穗凌超级恒温器：上海申生科技有限公司；超声波药品处理器：济宁金百特电子有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 固定化单宁酶的制备 固定化载体壳聚糖参考陈盛[11]的方法进行制备，取固定化载体1 g，加入单宁酶溶液(200 U·g-1)5 mL，超声波室温Ⅰ波段强档振荡30 min，9℃下保温2 h，离心收集沉淀，贮存在冰箱(0～9℃)中备用。

1.3.2 酶活力的测定 称取固定化酶0.1 g按照参考文献[12]测定活力。

1.3.3 固定化单宁酶澄清茶汤工艺的单因素试验 将0.5 g固定化单宁酶置于茶汤中，将pH值控制在茶汤自然pH 4.7～5.0之间，保温处理一定时间，再将处理前后的茶汤同时置于5℃下平衡l5 min，然后在640 nm下测定茶汤的吸光度[9]，计算其澄清度，公式如下：

以茶汤澄清度为评价指标，设固定温度30℃、时间20 min，考察酶用量(0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%)对茶汤澄清度的影响；以选取最优的酶用量和时间20 min为固定因素，温度(20、30、40、50、60℃)为变量考察温度对固定化单宁酶改善茶汤澄清度的影响；以选取最优的酶用量和温度为固定因素，考察时间(20、50、80、110、140 min)对固定化单宁酶改善茶汤澄清度的影响，上述单因素试验确定最优的固定化单宁酶与茶汤澄清度的互作参数。

1.3.4 正交试验 单因素试验基础上，根据L9(33)正交实验方案研究酶用量(A)、温度(B)、时间(C)等参数对固定化单宁酶提取茶汤澄清度的影响，试验因素和水平设计见表1。

表1 L9(33)各因素和水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1为时间20 min、温度30℃条件下不同酶用量绿茶茶汤的澄清度变化。结果可见，酶用量0.5%～1.5%之间时，茶汤澄清度急剧增加，酶用量大于1.5%时茶汤澄清度基本未见显著性差异变化，表明1.5%添加量可作为最佳的酶用量。以酶用量1.5%、时间20 min为固定条件进一步考察不同温度下固定化单宁酶对茶汤澄清度的影响，结果见图2。可以看出，温度小于40℃时，呈浓度依赖效应，随着温度的增加澄清度明显增加；温度50～60℃时，茶汤澄清度反而降低，这与反应温度过高破坏固定化单宁酶的活性有关，从而选取40℃作为最佳反应温度。以酶用量1.5%、温度40℃为反应条件，考察时间因素对固定化单宁酶改变茶汤澄清度的影响，与酶用量和温度的变化趋势相同，短时间内茶汤的澄清度变化明显增加，至50 min后基本未见变化，因此，选取50 min作为固定化单宁酶对茶汤的作用时间。

图1 酶用量对茶汤澄清度的影响Fig.1 Effects of enzyme concentration on solution clarification of tea extraction

2.2 正交实验优化固定化单宁酶澄清茶汤工艺条件

单因素试验基础上，通过正交试验评价优化了固定化单宁酶不同因素作用下澄清茶汤的工艺条件，结果见表2。直观分析可知，各因素对固定化单宁酶澄清茶汤影响的主次序为B>A>C，温度为主要的影响因素，其优水平为A2B2C1。正交试验方差分析表明，酶用量、温度、时间等因素皆可显著影响固定化单宁酶对茶汤的澄清作用，其中温度呈极显著影响(表3)。进一步通过因素不同水平间的差异显著性SSR分析可知(见表4)，酶用量不同处理间皆存在差异显著性(p<0.05)，低剂量(酶用量0.5%)与高剂量间具有极显著性差异(p<0.01)，以酶用量1.5%效果最好；温度因素不同处理间见极显著性差异，表明该因素影响最大，以40℃效果最佳；时间因素的影响较小，不同处理之间未见极显著性差异，从生产成本及效率方面考虑可确立20 min为最佳作用时间。由此，获得固定化单宁酶澄清茶汤的最优水平组合为B2A2C1，即酶用量1.5%、温度40℃、时间20 min，此工艺条件下，固定化单宁酶作用后茶汤可显著澄清。

图2 温度对固定化单宁酶提高茶汤澄清度的影响Fig.2 Effects of temperature on immobilized tannase increasing the solution clarification of tea extraction

图3 时间对固定化单宁酶提高茶汤澄清度的影响Fig.3 Effects of time on immobilized tannase increasing the solution clarification of tea extraction

表2 正交试验L9(33)结果

表3 正交试验L9(33)方差分析

3 结论与讨论

冷后浑(茶汤沉淀)一直是茶饮料及速溶茶生产过程中难以解决的问题，解决途径主要有原料控制、工艺参数(碱转溶、冷却沉降)、酶调控等技术，尤以酶技术被视为生产上主要的使用方法。常用来处理的酶类包括单宁酶、果胶酶、纤维素酶及蛋白酶等[8-10, 13-14]。本文以绿茶(龙井)为原料，采用固定化单宁酶来澄清茶汤，通过采用单因素试验、正交试验及SSR检验分析，获得固定化单宁酶澄清茶汤最佳工艺条件为酶用量1.5%、温度40℃、时间20 min，茶汤澄清度极显著改善。单宁酶可降解茶叶中的酯型儿茶素组分，通过断裂没食子酸单宁中的酯键和缩酚键，形成分子量较小的短链物质，从而改善速溶茶粉及茶饮料的澄清度和稳定性[10, 15-16]，在茶叶深加工领域已引起广泛关注。然而，限于酶活性较低、稳定性差、成本高等因素，其应用仍待进一步开展。

表4 因素水平间差异显著性的SSR检验

固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生物工程技术。酶的固定方法主要有吸附法、包埋法、共价键结合法以及不同方法的协同使用，从而实现酶反应工业化、连续化，提高效率、降低生产成本[17]。Su等采用交联-包埋-交联法固定化单宁酶，研究发现固定化单宁酶的活性回收率可达76.6%，储藏42 d后活性保留量为72.5%，30次重复使用后固定化单宁酶的残留活性为86.9%，显示出较好的储藏稳定性和重复使用性[18]。苏二正等通过分析比较海藻酸钠和壳聚糖两种载体及不同固定化方法对单宁酶和β-葡糖糖苷酶的固定化效果，结果表明以海藻酸钠为载体，采用交联-包埋-交联固定化法的效果最佳[19-20]。本文从生产实际出发，以壳聚糖为载体开展了单宁酶的固定化制备，更加符合工业化发展的应用，结果表明工艺简单可行、应用效果佳，对茶汤具有良好的澄清效果，在速溶茶产业及茶饮料领域具有积极的应用意义。

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