缺磷对茶树磷吸收及miR399a表达量的影响

陈志辉，林郑和，游小妹，钟秋生，单睿阳，陈常颂

(福建省农业科学院茶叶研究所/国家茶树改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

磷素缺乏是我国及世界农业生产中影响作物产量的一个限制因子。据统计，当今全世界的耕地中约有43%缺磷[1]，而我国约有2/3的耕地严重缺磷[2]。磷元素的缺乏可导致植物幼芽和根部生长缓慢、叶小、分枝减少、植株矮小、花果少等症状[2]。在缺磷条件下，植物会形成一种应对机制，以提高磷的利用率[3]，某些microRNA(miRNA)基因(miR399、miR827等)在这其中起重要作用[4-6]。miRNA是一类内源性的非编码单链小分子RNA[7]，其前体具有发夹结构[8-9]，长度约为20～23 nt[10]。miRNA 作为基因表达中的一类负调控子，主要在转录后水平上通过与靶mRNA结合，介导靶mRNA 切割降解或抑制翻译来调节植物基因的表达[8,11-12]。许多植物的miRNA 成熟序列呈现高度保守并出现独特的表达时序性、组织及发育特异性或逆境特异性。在植物新陈代谢、组织生长、器官发育及分化、细胞程序性凋亡中起重要作用[13-14]。miRNA 还参与植物生物及非生物逆境胁迫过程，不同的miRNA 对不同逆境胁迫发生响应，并证实某些miRNA在植物感受逆境胁迫并产生适应性的过程中发挥重要作用[15]。

植物对磷的吸收利用过程极其复杂[16-18]，目前植物中大量关于低磷胁迫诱导基因的研究(包括miRNA基因的表达和调控)在一定程度上揭示了植物低磷响应机制[19-20]。有研究表明，低磷胁迫下拟南芥基因组中有6个miR399受诱导表达，分别是miR399a-f[21]，在拟南芥中超表达miR399成员造成磷吸收过量而出现中毒表型，现已证明miR399家族是一类与植物耐低磷胁迫密切相关的小RNA家族[22-23]。水稻、大麦等植物中有关miR399参与调控磷元素的吸收利用的相关报道较多[5,24-25]。虽然在多种植物中都报道了低磷胁迫诱导miR399的表达及其调控路径[3,18]，但在茶树中有关磷吸收与miR399表达和调控机制的相关报道仍未见到，到目前为止还无法确定茶树基因组中miR399家族有多少个成员，在查阅的文献中发现仅有一篇报道茶树中存在miR399a和miR399b[26]。通过对比，发现茶树中miR399a和miR399b都为21个碱基，只有3′端最后一个碱基差别，而miR399a与其他物种中miR399成员的同源性更高。鉴于此，本研究以茶树幼苗为试验材料，通过不同磷浓度胁迫处理，检测茶树对磷素的吸收利用情况以及miR399a在缺磷条件下的响应状况。

1 材料与方法

1.1 试验材料的培养与取样

试验于2017年在福建省农科院院部大楼进行。选生长一致的10月龄的扦插‘瑞香’茶苗为试验材料，盆栽于6 L的装满沙的花盆，每盆栽3株，于自然温、光条件下培养。营养液参考文献[27-28]，完全营养液包含1 mmol·L-1(NH4)2SO4，1 mmol·L-1NH4H2PO4，2 mmol·L-1KNO3，0.6 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.5 mmol·L-1CaCl2，30 μmol·L-1EDTA·Na2Fe，46 μmol·L-1H3BO3，9 μmol·L-1MnSO4·H2O，9 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，2 μmol·L-1CuSO4·5H2O，2.6 μmol·L-1Na2MoO4，0.035 mmol·L-1A12(SO4)3·18H2O。移栽后8周进行缺磷处理，每处理重复6次，每盆施含3000 μmol·L-1、1000 μmol ·L-1、100 μmol·L-1、10 μmol·L-1浓度磷的营养液约500 mL，每周3次，处理15周后采集根、叶进行分析。

1.2 磷含量检测

采用钼锑抗比色法测定，参照《植物生理学测试技术》[29]。

1.3 Stem-loop RT-PCR检测miRNA的表达量

采用stem-loop RT-PCR的方法检测miRNAs的表达量[30]。按照Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)试剂盒的说明书提取茶树不同组织的总RNA，取样部位为新叶和根，新叶为倒数第二叶的完全叶，根为有活力的白色根，3次重复。提取总RNA后，检测RNA浓度和质量，检测试剂盒为Agilent 2100 RNA 6000 Nano kit。总RNA反转录用TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix kit(TRANS，AT301)，反转录引物为基因上的特定引物stem-loop RT prime(MIR399a-St-RT)或者作为对照的内源基因引物U6-R。反应体系为：50 ng total RNA，0.5 μM stem-loop RT primer或U6-R primer，2×TS Reaction Mix 2.5 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 0.25 μL，加RNase-free water到5 μL。把这5 μL反应混合物放在ABI 9700 thermocycler (Applied Biosystems，http://www.appliedbiosystems.com/)PCR仪上：16℃ 15 min，42℃ 50 min，70℃ 15 min，降到4℃，反应完毕。以上所有反转录试验都3次重复。Real-time PCR是在ABI PRISM 7500 PCR仪上进行(Applied Biosystems)。25 μL PCR体系包含5 μL RT product，forward primer和reverse primer各0.4 μM，0.5 μL Rox Reference Dye II 和1×SYBRPremixEXTaq(Takara)，加ddH2O到25 μL。反应程序为：95℃ 10 s，然后是95℃ 5 s和60℃ 34 s 共40个循环。溶解曲线分析按照以下程序：95℃ 15 s、60℃ 20 s和95℃ 15 s。所有反应数据都保存在 ABI PRISM 7500 sequence detection system上，并按说明书分析或导出分析。以上所有引物序列见表2。

2 结果与分析

2.1 磷胁迫处理对茶树不同组织磷含量的影响

在4种磷浓度(3000、1000、100、10 μmol·L-1)下胁迫处理15周后，检测茶树根、新叶(从上往下数第二叶)、老叶(从上往下数第8叶)的磷含量，见图1。

图1 不同磷浓度胁迫下，茶树根、新叶、老叶中的磷含量Fig.1 phosphorus contents in roots, young shoots and old leaves of tea plants under phosphorus stresses

分析图1发现，不同磷浓度处理下，根、新叶、老叶中磷含量都随着处理浓度的下降而降低，其中老叶中磷含量变化最显著。

在磷肥过量的条件下(3000 μmol·L-1)，老叶中磷含量最高，其次是根，然后是新叶，根和新叶磷含量接近，而老叶磷含量是根和新叶的两倍多，说明茶树在磷肥过量的环境中生长时，把吸收的过量磷元素存储在老叶中。

在正常的施肥条件下(1000 μmol·L-1)，根中磷含量最高，依次是新叶和老叶，而根和新叶含量相当，其中老叶磷含量比在过量磷肥条件下显著下降，约为新叶的一半。从老叶的磷含量比新叶低，说明在正常的磷肥条件下，老叶中的磷元素会转移到其它更需要磷营养的新生组织中，重复利用磷元素，提高利用效率，保障植物的生长发育。

在缺磷条件下(100 μmol·L-1、10 μmol·L-1)，新叶磷含量最高，根和老叶的磷含量都急剧下降，但根的磷含量仍显著高于老叶。在4种磷浓度处理中，新叶是3个部位中磷浓度变化最小的器官，说明茶树在生长过程中出现缺磷状况时，首先保证新生组织等重要部位磷元素的供应，最大限度的减少非重要器官的磷含量，以维持基本生存需求。

2.2 磷胁迫茶树总RNA提取与质量检测

提取正常(1000 μmol L-1)和低磷(10 μmol L-1)2种处理茶树的新叶与根的总RNA，并检测RNA浓度和质量，从RNA电泳图(图2、图3)可以直观地看出每个RNA样品的质量。而RIN值(RIN=RNA integrity number，即RNA分子完整数，从0～10，直接反应了RNA质量的好坏，此数值越大表明RNA质量越好越完整)也表明提取的总RNA质量较好，绝大部分在8左右，仅有一个为6.6，都能满足反转录需求。从每个样品的浓度和体积，得出样品的RNA总量(表1)，分析表1发现叶片提取的RNA总量比根高出较多，其中8号和11号的根部RNA总量仅有1.79 μg和2.77 μg，基本满足反转录要求。从RNA总量可以判断叶片基因表达比根丰富。

图2 电泳检测磷胁迫处理茶树提取的总RNAFig.2 Electrophoresis of total RNA extracted from tea plants under phosphorus stresses注：1～3号样为低磷胁迫(10μmol L-1)的茶树叶片(3个生物学重复，以下相同)，4～6为正常磷浓度处理(1000 μmol L-1)的茶树叶片，7～9为低磷胁迫的根，10～12为正常磷浓度处理的根。下同。

2.3 磷胁迫对茶树miR399a表达的影响

试验采用Stem-loop RT-PCR的方法检测miR399a的表达量[30]。反转录引物的径环序列为 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3′，3′端加上与miR399a成熟序列5′-UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG-3′的3′端互补的6个碱基5′-CAGGGC-3′，形成反转录引物MIR399a-St-RT：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGGGC-3′。荧光定量PCR的正向引物取miR399a成熟序列的5′端15个碱基，然后在5′端上加上4个碱基5′-CGGC-3′，获得正向引物MIR399a -F：5′-CGGCTGCCAAAGGAGAGTT-3′。反向引物为反转录引物径环序列上的一段碱基，MIRNA-R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。荧光定量PCR的内参引物为U6-F和U6-R。以上引物序列见表2。

图3 磷胁迫处理茶树总RNA电泳检测Fig.3 Electrophoretic detection of total RNA from tea plants under phosphorus stresses

表1 磷胁迫处理茶树提取RNA的浓度、总量及RIN值

通过荧光定量PCR方法，检测正常和低磷胁迫下叶片和根中miR399a的表达量，了解磷胁迫对茶树miR399a表达量的影响，见图4。

分析图4发现，茶树在低磷胁迫下，miR399a的表达量在叶片和根中都显著提高，其中低磷胁迫的叶片比正常磷供应的叶片表达量提高约2.77倍，而低磷胁迫的根比正常磷处理的根表达量提高约3.82倍。说明茶树在低磷环境中，能够诱导miR399a提高表达量。已知在拟南芥和水稻等植物中，miR399表达量提高有助于植物吸收利用土壤中的磷，而过量表达miR399甚至引起植物磷吸收过量而造成磷中毒现象，以上结果说明miR399在茶树磷吸收中的功能与其它植物相似。已有研究发现miR399是通过抑制靶基因来实现它的调控功能，茶树中是否存在其它植物同源的靶基因，还需要后续实验进一步验证。下一步将开展miRNA与mRNA表达谱测序，分析低磷胁迫中茶树miR399的调控路径。

表2 引物序列

图4 正常和低磷胁迫下miR399a在叶和根中的相对表达量Fig.4 Relative expressions of miR399a in leaves and roots under normal and low phosphorus supplies

3 讨论

已有文献中有关植物体内磷元素从衰老器官转运到新生器官，实现磷元素高效利用的研究报道较多，但是茶树中却鲜有报道。本研究发现在不同磷浓度胁迫处理下，茶树不同器官对磷元素的吸收利用各不相同，其中在缺磷或者正常磷浓度条件下，茶树中老叶部位的磷元素都会重新转运到新生组织等重要部位，实现磷元素的再次利用，但在过量磷浓度条件下，茶树会把过量的磷元素储存于老叶中，避免新生组织出现磷中毒，维持体内磷元素的平衡。此研究结果有助于充实茶树对磷元素吸收利用的试验数据。

本研究发现茶树在缺磷条件下，引起miR399a表达量的提高，这与其它植物的研究结果相一致[5-6]。大量研究都发现植物在低磷条件下，miR399受环境中磷酸盐水平强烈诱导，表达量提高，其靶基因PHO2(UBC24)的mRNA丰度下降，而恢复供磷时miR399又急剧下降，恢复正常表达水平[31-32]。miR399与靶基因PHO2(UBC24)的mRNA水平在正常和低磷胁迫时均存在着一个倒置的关系，低磷胁迫下，miR399通过与PHO2(UBC24)-mRNA的3′-UTR结合，从而实现对其mRNA的降解或抑制其翻译，PHO2(UBC24)蛋白表达量的下调能够促进植物根部的生长、提高磷高亲和力转运子的表达(如AtPT1)[33]，从而提高对磷的吸收利用以应对磷素缺乏[23]。高磷环境下，miR399 的表达却受到抑制，根部 PHO2(UBC24)基因的表达量增加，抑制过量无机磷进入植物体内，使其免于磷中毒。有研究表明，PHO2(UBC24)的突变体(pho2)具有在茎和叶中积累磷的功能[17]。总之，miR399在保持植株体内磷的平衡和稳定方面具有重要的作用[5,34-37]。有研究发现除miR399外，还存在其他的miRNAs基因参与磷胁迫响应。拟南芥在缺磷条件下还诱导miR778、miR827表达，抑制miR398的表达[38]，其中miR827的靶基因是E3连接酶NLA(Atlg0260)，NLA参与植物花青素合成，缺磷条件下miR827会抑制NLA表达。另外大豆在缺磷胁迫下miR159、miR894、miR1507、miR1509等基因表达量上调，而miR165/166、miR398、miR1450、miR1511等表达量下调[39]。

虽然其它植物中有关miR399通过抑制靶基因表达，从而调节植物对磷元素吸收利用的报道较多，但在茶树中没有发现相关报道。miR399在茶树中是否存在同源的靶基因PHO2(UBC24)，以及靶基因PHO2(UBC24)如何调控下游的磷转运子基因PT1的表达，都需要进一步的深入研究。后续研究将检测不同磷浓度胁迫下mRNA和miRNA的表达谱，获得与磷吸收转运的相关基因，重点研究miRNAs与靶基因及下游基因的表达调控模式，从而了解茶树在磷胁迫后不同基因的应急反应，获得miRNAs在磷胁迫反应中的调控路径，为探明茶树磷吸收转运机理提供依据。

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