滩羊12个微卫星基因座遗传多态性研究

马丽娜，马 青，李颖康

（宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750002）

微卫星（microsatellite）一般由大小为2～6 bp的DNA分子组成核心序列，通常重复10～20次，首尾相接组成短串联重复 （short tandem repeat，STR），又称为简单序列重复（simple sequence repeat，SSR）。微卫星普遍存在于真核生物的基因组中，平均每10 kb就出现一个STR。微卫星因具有数量多、分布广、多态性丰富、呈共显性遗传方式以及检测快速方便等优点而备受推崇。笔者以滩羊为研究对象，在参考国内地方品种绵羊微卫星研究的基础上，选取12个对滩羊体重有影响的数量性状基因座（quantitative trait locus，QTLs），通过分析这些标记在滩羊群体中的遗传变异特征，以期为滩羊种质特性研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验滩羊51只，来自盐池滩羊繁育中心核心育种群。用采样剪剪取羊耳组织块少许作为试验材料，放入-20℃冰箱中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取：利用磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒进行样本DNA提取。

1.2.2 微卫星标记与引物合成：根据已发表的绵羊基因组遗传连锁图谱以及绵羊和牛相关QTLs定位的研究成果，从GenBank数据库中选取绵羊染色体上的12个微卫星标记，其中，从第1号染色体上选取8个微卫星标记，分别为：BM6506、BM7145、BMS2263、ILSTS004、MCM58、BMS1636、CSSM004、MCM130；从绵羊第2号染色体上选取4个微卫星标记，分别为：BL1080、BMS678、ILSTS30、BMS1591。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物用4种荧光染料FAM、ROX、TAMRA和HEX进行标记，全部标记经多重PCR反应优化组合。选取的12个微卫星标记位点的引物信息见表1。

1.2.3 建立最佳PCR反应体系与条件：采用25 μL多重 PCR 反应体系，其中，样本 DNA（50 ng）1 μL，上游引物 F（100 mmol/L）0.5 μL，下游引物 R（100 mmol/L）0.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2.0 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。 PCR 反应条件为：95℃预变性 3 min；95℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 30 s，循环数 10个；95℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循环数 20个；72℃修复延伸6 min。

1.2.4 PCR产物的检测：多重PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳条件为：电压150 V，电流100 mA，时间20 min。

表1 12个微卫星标记位点引物

1.3 数据分析

使用Genemapper软件分析STR数据。

2 结果与分析

2.1 12个微卫星位点电泳检测结果

12个微卫星位点多重PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1和图2。由图1和图2可知，各微卫星标记均表现出明显的多态性。随机抽样进行重复试验，结果表明，微卫星扩增结果稳定，重复性好。

2.2 12个微卫星多重PCR产物测序结果

将多重PCR产物送往生工生物工程 （上海）股份有限公司进行序列测定。根据12个微卫星多重PCR产物测序结果，得到有多态性的12个微卫星标记在滩羊群体中的等位基因频率和等位基因型频率。由表2可知，在滩羊群体的12个微卫星标记中共检测到109个等位基因，平均每个标记的等位基因数为9.08个，其中标记BMS678等位基因数最多，为14个；标记BMS1636的等位基因数最少，只有5个。微卫星位点选择标准为：每个微卫星位点至少应有4个等位基因才能很好地用于遗传多样性评估。而该试验所选取的12个微卫星位点检测到的等位基因均在4个以上，因此，有多态性的这些位点都可以用于滩羊群体的遗传多样性评估。

图1 9个微卫星多重PCR产物电泳检测结果

表2 滩羊12个微卫星位点的等位基因及基因型特性

表2（续） 滩羊12个微卫星位点的等位基因及基因型特性

图2 3个微卫星多重PCR产物电泳检测结果

2.3 12个微卫星基因座群体遗传学分析结果

由表3可知，所选微卫星标记等位基因数较多，平均达8个，多态信息含量（PIC）平均值为0.777 1，微卫星纯合度（G）平均值为 0.148 0，微卫星标记杂合度（H）平均值为0.724 4，表明微卫星标记多态信息含量丰富，为QTLs的定位提供了强有力的数据支撑。

3 讨论

基因纯合度是每个个体的纯合基因座占总检测基因座的比例。该研究选取的12个微卫星位点中，BMS1636的纯合度最小，BL1080的纯合度最大。该研究检测的滩羊群体平均基因纯合度为0.148 0。多态信息含量（polymorphism information content，PIC）是衡量基因片段多态性或基因变异程度的一个指标，当PIC＞0.5时，该基因座为高度多态基因座，当0.25＜PIC＜0.5时为中度多态基因座，当PIC＜0.25时为低度多态基因座。根据该判定标准，笔者所选择的12个微卫星位点均为高度多态基因座。杂合度又称为基因多样度，其反映群体在多个基因座上的遗传变异特征，一般认为它是度量群体遗传变异的最适参数。在该研究中，BM7145、BMS2263、ILSTS30 和 BMS1591 微卫星基因座的等位基因频率分布不均匀，每个基因座都有一种或几种等位基因频率较高。微卫星的多态性能够反映物种的进化历史，群体中频率最高的等位基因是该物种中最原始、最保守的，其余的等位基因是进化过程中由该等位基因突变形成的。BM7145基因座的119bp等位基因、BMS2263基因座的152 bp等位基因、ILSTS30基因座的153 bp等位基因、BMS1591基因座的230 bp等位基因可能是绵羊相应微卫星基因座最原始的等位基因。

表2（续） 滩羊12个微卫星位点的等位基因及基因型特性

古丽尼沙·吐拉甫［1］以新疆山羊和青格里绒山羊为研究对象，选取17个微卫星标记，发现4个特殊的微卫星位点，新疆山羊微卫星标记BM1824的AD基因型个体、青格里绒山羊微卫星标记BM1824的BE基因型个体、BM6506的CC基因型个体和LSCV15的BD基因型个体，不仅绒细度较细，而且产绒量指标也比较理想。苏杰［2］采用微卫星标记和PCR-RFLP 2种方法寻找与波尔山羊生长以及繁殖性状相关的标记，发现3个微卫星位点（LSCV11、MCM218、MAF050）在山羊群体中多态性较丰富，可以用于山羊遗传多样性的评估。任正平［3］研究发现，2号染色体的6个微卫星位点在湖羊群体中均属于高度多态性标记，具有较高的应用价值，可作为有效的遗传标记用于绵羊遗传多样性的分析。贾兰萍［4］利用第1号染色体上11个微卫星标记，采用父系半同胞设计对凉山细毛羊体重QTLs进行了研究。张翔宇等［5］在绵羊第1、2、3、9号染色体上选取了22个微卫星基因座，其中5个微卫星基因座对体重影响显著。顾亚玲等［6］将宁夏地区普遍饲养的5个品种169只羊的4个微卫星基因座作为候选标记，对其多态性进行遗传检测，发现5个品种在4个位点均表现出多态性。储明星等［7］利用5个微卫星标记（OarAE101、BM1329、BMS2508、TGLA54 和 TGLA68）对 244 只小尾寒羊母羊进行遗传检测，发现OarAE101基因座的97 bp等位基因、BMS2508基因座的99 bp等位基因、BM1329基因座的164 bp等位基因、TGLA54基因座的134 bp等位基因可能是绵羊相应微卫星基因座最原始的等位基因。

表3 12个微卫星遗传信息分析结果

4 结论

位于绵羊第1号染色体的BM7145基因座的119 bp等位基因和BMS2263基因座的152 bp等位基因以及位于绵羊第2号染色体的ILSTS30基因座的153 bp等位基因、BMS1591基因座的230 bp等位基因，可能是绵羊相应微卫星基因座最原始的等位基因，这些基因型可作为滩羊遗传多样性分析的分子标记。

参考文献：

［1］古丽尼沙·吐拉甫.新疆地方山羊品种微卫星标记遗传多态性与部分经济性状的关联性分析［D］.乌鲁木齐：新疆农业大学，2013.

［2］苏杰.7个微卫星标记与波尔山羊生长性状的关联分析［D］.武汉：华中农业大学，2009.

［3］任正平.湖羊2号染色体6个微卫星多态性及其与早期生长性状的相关性研究［D］.南京：南京农业大学，2006.

［4］贾兰萍.利用微卫星标记进行凉山半细毛羊体重QTL研究［D］.雅安：四川农业大学，2002.

［5］张翔宇，张秀华，吴登俊，等.凉山半细毛羊微卫星标记与体重性状的相关关系的研究［J］.中国畜牧杂志，2009，45（11）：1-5.

［6］顾亚玲，王新燕，吴宗山.微卫星DNA技术在肉羊杂种优势利用中的研究［J］.畜牧与兽医，2009，41（5）：59-61.

［7］储明星，王吉振，王爱国，等.小尾寒羊五个微卫星基因座遗传多态性研究［J］.遗传学报，2002，29（6）：502-506.