miR-200调控PAPD5蛋白对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响

肖文波，黄会林，冯彦娜，曾春琴

卵巢癌是全球女性最常见的生殖系统肿瘤，每年将近有150万新发病例，也是病死率最高的妇科肿瘤，2015年统计约50万人死于卵巢癌[1-3]。在2016年，估计中国妇女将有30万卵巢癌新发病例及近10万死亡病例[4]。由于卵巢癌早期诊断困难，临床症状及早期血清学指标不明显，因此寻找有效的分子学诊断标志物对卵巢癌的诊断和预后有重要意义。miRNA是由22～24个核苷酸通过非编码小RNA结合到3'-非翻译区(3'-UTR)的靶向mRNA[5]。基于最新研究发现，已发现1881个miRNA前体和2588个成熟miRNA[6]。越来越多的证据表明，miRNA可以在多种肿瘤中充当肿瘤抑制剂(如miR-34、miR-125、miR-200家族)，通过调节相关转录因子发挥调控基因表达的作用[7-8]，而miRNA异常表达参与肿瘤的发生、发展过程和肿瘤细胞迁移、侵袭相关信号途径的激活[9-10]。PAPD5是人细胞中非经典聚合酶家族的7个成员之一。PAPD5在体内是聚腺苷酸化的蛋白前体[11]。有研究报道，PAPD5参与组蛋白mRNA的尿苷酸化依赖性降解，可以影响肿瘤细胞生长和转移[12]。最近又有研究报道，PAPD5在肝癌组织中表达水平增高，可以激活相对静止状态的肝癌细胞进行快速扩增[13]。本研究探讨miR-200和PAPD5在卵巢癌中的表达情况及二者对卵巢癌细胞迁移侵袭能力的影响。现报告如下。

1 资料与方法

1.1组织样本 收集2016年7月—2017年7月于湖北省宜城市人民医院进行的卵巢癌切除手术的卵巢癌组织和癌旁正常卵巢组织各30例。本研究经过医院医学伦理委员会同意。卵巢癌组织经过组织病理学的证实。切除的肿瘤组织样本立即放入液氮中冷冻并储存在-80℃直至RNA提取。

1.2细胞株及相关材料 卵巢癌细胞株SKOV3、ES2、A2780均获自武汉大学典型培养物保存中心。细胞培养条件：在RPMI 1640培养基中加入1%青霉素/链霉素。用5%胎牛血清在5% CO2空气湿润培养箱中37℃恒温培养。兔克隆单抗PAPD5购于abcam公司(Sigam，FLJ40270)。miR-200-mimic和miR-200-inhibitor购自于上海吉玛基因有限公司。SsoFast EvaGreen试剂及Lipofectamine2000转染试剂购于TAKARA公司。

1.3细胞转染 设定MOI值为0、20、50、200，观察荧光细胞表达的比例，选取荧光细胞比例最高且对细胞毒性最小的MOI值设定为最佳MOI值，测量得最佳值为50。调节细胞至对数生长状态，细胞转染前36 h接种于24孔板培养，第2天细胞密度达到50%～80%融合状态。将病毒置冰上融解后，按最佳MOI值用培养液稀释，加入终浓度为5 ng/ml的凝聚胺，轻轻混匀后加入到细胞中，将miR-200-mimics、miR-200-inhibitor和阴性对照组转染细胞；按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书将miR-200-mimics、miR-200-inhibitor和阴性对照转染细胞。在培养箱中孵育12 h后换上完全培养基。

1.4qPCR检测miR-200的表达 将A2780卵巢癌细胞接种于6孔板，接种密度为1×106个/L，培养36 h后按照Trizol说明操作提取细胞总RNA，使用紫外分光光度计检测核酸浓度和纯度。用在SsoFast EvaGreen试剂(Bio-Rad)中以1∶10稀释的cDNA进行qPCR测量。将表达数据标准化至相应的参照基因。检测基因反应条件为：37℃ 15 min，98℃ 5 min。后根据PCR试剂盒说明书进行PCR反应。以RQ=2-ΔΔCT计算mRNA表达量。

1.5蛋白免疫印迹分析 提取A2780卵巢癌细胞蛋白检测PADA5的表达水平。配置SDS-PAGE电泳胶，取免疫沉淀最后所得的上清，上样，每孔30 μl，电泳。用电转移装置将蛋白转至PVDF或NC膜上。电转移完毕后，用膜洗涤1次。将膜放入5%牛奶封闭液于室温封闭1 h，或4℃封闭过夜。用封闭液稀释目标蛋白抗体(PAPD5)1∶2000，室温下孵育作用2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。稀释酶标记二抗1∶500，室温下孵育30 min。TBST洗膜3次，每次10 min。ECL显影剂显影，使用Image Lab 3.0(Bio-Rad)进行分析。实验重复3次。

1.6Transwell侵袭实验检测miR-200对卵巢癌细胞侵袭能力的影响 所有试剂及器材均于冰上预冷，将Transwell小室置于24孔板内，将Transwell小室内膜均匀涂抹Matrigel胶50 μl(0.2 μg/μl)，37℃孵育15 min，凝固胶后；消化、离心、计数卵巢癌细胞后，按照2.5×104个/ml用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液；按照每孔200 μl，将细胞悬液加入Transwell上室，同时在Transwell下室加入10%FBS+培养基600 μl，放入37℃孵箱培养；甲醛固定，结晶紫染色10 min，然后用棉签轻轻擦拭内膜上的细胞。显微镜下计数4个高倍视野(×40)下穿过滤膜的细胞数。实验重复3次。

1.7划痕实验检测miR-200对卵巢癌细胞迁移能力的影响

1.7.1细胞接种：将细胞密度调整为5×105个/ml，接种到6孔板中，放置于5% CO2温箱孵育过夜，使细胞融合度达到100%。

1.7.2细胞划痕实验：先用Marker笔在每个孔的背面做好标记，以保证获取数据的位置保持一致。用灭过菌的枪头比着直尺，垂直于标记线快速进行划痕,并用PBS缓冲液反复冲洗细胞孔，将悬浮细胞去除,向培养孔加入不含血清的DMEM培养基，放置于5% CO2的37℃孵箱孵育。

1.7.3拍照：按照试验设计中的时间点取样，在显微镜下拍照。测量划痕的初始距离(0 h)；在24、48、72 h后分别测量划痕的距离，并拍照，计算细胞迁移率。

2 结果

2.1miR-200在卵巢癌组织和不同卵巢癌细胞株中的表达 miR-200在卵巢癌组织和癌旁正常卵巢组织中的表达水平分别为8.12±0.98和3.06±0.46。miR-200在卵巢癌组织中的表达水平高于癌旁正常卵巢组织(P<0.05)。miR-200在A2780、ES2和SKOV3卵巢癌细胞株表达水平分别为7.93±0.96、4.93±0.62和1.36±0.26。miR-200在A2780卵巢癌细胞株中的表达水平高于ES2和SKOV3细胞株(P<0.05)。后续实验选取A2780细胞株作为实验对象。

2.2miR-200在A2780卵巢癌细胞株中调控PAPD5的表达 对照组PAPD5的蛋白水平为46.2±4.2，miR-200-mimic组和miR-200-inhibitor组培养50 h后分别为13.6±2.32和79.6±8.6。miR-200-mimic组PAPD5的蛋白水平低于对照组，miR-200-inhibitor组高于对照组(P<0.05)。见图1。对照组A2780的细胞活性为72.4±5.6，miR-200-mimic组和miR-200-inhibitor组培养50 h后分别为88.6±9.5和64.5±7.6。miR-200-mimic组A2780的细胞活性高于对照组，miR-200-inhibitor组低于对照组(P<0.05)。

图1 3组A2780卵巢癌细胞株PAPD5蛋白的表达

2.3miR-20对A2780卵巢癌细胞株迁移能力的影响 对照组A2780卵巢癌细胞迁移率为(47.5±4.7)%，miR-200-mimic和miR-200-inhibitor组处理50 h后为(67.3±5.1)%和(22.6±3.2)%。miR-200-mimic组A2780卵巢癌细胞迁移率高于对照组，miR-200-inhibitor组低于对照组(P<0.05)。

2.4miR-200对A2780卵巢癌细胞株侵袭能力的影响 对照组、miR-200-mimic组和miR-200-inhibitor组穿膜细胞数分别为(111.3±9.6)、(175.6±16.3)和(63.5±8.4)个。miR-200-mimic组A2780卵巢癌细胞株中穿膜细胞数高于对照组，miR-200-inhibitor组低于对照组(P<0.05)。

3 讨论

卵巢癌是一种由多种因素引起的女性生殖系统最常见的恶性肿瘤[14-16]。由于诊断水平存在一定缺陷，早期卵巢癌的诊断尚未达到满意的要求，对卵巢癌的治疗和预后不利[17-18]。随着分子生物学和生物检测技术的不断发展，卵巢癌的分子标志物获得越来越多的关注，检测卵巢癌的临床分子标记物，然后根据不同标记物的情况对卵巢癌患者采取个体化治疗是未来发展的方向[19]。

最近有大量研究表明，miRNA在不同肿瘤发生和转移中可能扮演重要角色[20]。肿瘤相关miRNA及其下游相关靶向因子的相互作用与恶性肿瘤的发生、进展和转移有潜在的联系[21]。因此，miRNA的研究可能为卵巢癌新型治疗方案和预后提供理论支持。盲目的去探索mRNA及其下游相关靶点的相互联系是耗时且昂贵的，我们应该选择合适方法去预测筛选相关的分子层面的联系。

使用生物信息学方法，我们预测miR-200可能在卵巢癌细胞增殖、侵袭、代谢和凋亡中起重要作用。据报道，miR-200在膀胱癌细胞中的高表达水平可以影响其病情进展，在人类肝癌细胞也存在高表达现象[22]。在后续验证研究中，我们发现miR-200可以显著促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭的进展。然而，尚缺乏关于miR-200在卵巢癌中的转移作用的具体机制。本研究结果显示，miR-200在卵巢癌组织的表达水平高于癌旁正常卵巢组织，miR-200-mimic组A2780卵巢癌细胞迁移率和穿膜细胞数高于对照组，提示过表达miR-200后可以明显促进细胞的迁移和侵袭，其可作为促癌基因促进卵巢癌的进展。另外，我们通过生物信息学方法预测PAPD5可能是miR-200的下游靶点。本研究结果显示，miR-200-mimic组PAPD5的蛋白水平降低，A2780的细胞活性升高。推测miR-200有可能通过调控下游PAPD5来影响卵巢癌的生物学功能。后续实验证明miR-200的表达水平可以调控卵巢癌细胞的侵袭和迁移，这与我们对miR-200功能预测是一致的。

综上所述，我们通过研究miR-200与下游PADA5靶点相互作用对卵巢癌细胞的生物学行为的影响证实了我们的猜测，补充了miR-200在卵巢癌中的生物信息学机制。目前的研究表明miR-200对卵巢癌的迁移和侵袭是至关重要的，为miR-200对卵巢癌的临床诊断和生物学治疗提供了新的理论方法。

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