小凹蛋白-1调控表皮生长因子受体活化对恶性黑色素瘤细胞生物学行为的影响

张玫莹，朱铁年，赵瑞景，崔玉洁，范 婧

恶性黑色素瘤是起源于胚胎期神经嵴的恶性肿瘤，恶性程度高，预后较差，发病率为全部恶性肿瘤的1%～3%，且呈上升趋势。手术、放疗、化疗一直是恶性黑色素瘤治疗的主要方法，但其对于放疗和化疗并不敏感。近年来，随着黑色素瘤相关突变基因的发现与深入研究，分子靶向药物为其治疗带来了新的希望。因此，探索更多的有效靶点成为治疗的关键。表皮生长因子(epidermal growth factor， EGF)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor， EGFR)可参与正常细胞和异常细胞的增殖、迁移和存活。目前有研究证明，在人类多种肿瘤中均可发现EGFR过表达现象，且EGFR的表达水平与治疗效果差、疾病恶化快及存活率低有关[1-4]。小凹蛋白-1(caveolin-1, Cav-1)是分子量为21～24 KDa的膜内在蛋白，是膜内陷囊泡的重要标志性结构蛋白。Cav-1由178个氨基酸残基组成，位于肽链中的疏水残基(102-134)在膜结构上形成特殊的发卡样结构，将Cav-1蛋白分成N端及C端两个区域，其中N端为主要的功能区域，该区域通过与EGFR相连接，从而调控EGFR酪氨酸激酶的活性。研究显示Cav-1可在膀胱癌等细胞系中发挥抗肿瘤作用[5]，而其通过调控EGFR在恶性黑色素瘤细胞中发挥作用的研究尚未见报道。本研究以恶性黑色素瘤M2细胞为研究对象，旨在探讨过表达Cav-1后对M2细胞生物学行为的影响，并进一步探讨其可能的作用机制及影响的信号通路，为恶性黑色素瘤的治疗提供理论基础。现报告如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞来源：恶性黑色素瘤M2细胞系由美国国立卫生研究院老年病研究所Michel Bernier教授惠赠。

1.1.2试剂：Cav-1质粒、pcDNA3.1阴性对照质粒(本实验室保存)；G418(美国Amresco公司)；MEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；Human EGF(美国Sigma公司)；MTS(美国Promega公司)；p-EGFR、Akt、p-Akt单克隆抗体(美国Cell Signaling technology公司)、EGFR、Cav-1、β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG(美国Proteintech Group公司)；ECL超敏发光液(碧云天生物技术公司)。

1.1.3仪器：CO2培养箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；低温高速离心机(美国Thermo公司)；酶标仪(美国Thermo公司)；超低温冰箱(美国Thermo公司)；24孔Transwell小室、96、24、6孔细胞培养板(美国Corning公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养：恶性黑色素瘤M2细胞用含10% FBS的MEM培养基培养，置于37℃、5% CO2、饱和湿度无菌培养箱中常规培养，选取对数生长期的细胞进行进一步实验。

1.2.2质粒转染：培养低表达Cav-1的M2细胞至60%～80%融合，分别转染pcDNA3.1阴性对照质粒和Cav-1质粒。48 h后加入G418进行抗性筛选。蛋白免疫印迹(Western blot)法验证Cav-1表达情况。

1.2.3MTS检测细胞增殖情况：培养M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞，无胎牛血清培养基饥饿4 h，分别加入浓度为0、4、20和100 nmol/L的EGF溶液，培养44 h，弃去旧培养基，按MTS 20 μl/孔与MEM培养液100 μl/孔混匀，每孔加入120 μl，避光操作。酶标仪上检测490 nm波长处各孔的吸光度(OD值)。记录并分析数据。此实验重复3次。

1.2.4细胞划痕实验检测细胞划痕治愈率：培养M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞，无胎牛血清培基饥饿4 h，以20 nmol/L EGF刺激。每5小时用倒置显微镜观察划痕愈合情况，并拍照，直至其愈合。使用测量软件分别测量各组细胞各个时间点划痕愈合的宽度，并以起始宽度为1，计算其他各时间点划痕相对宽度值，统计分析结果。此实验重复3次。

1.2.5Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力：制备基质胶工作液，均匀铺于Transwell小室滤膜上层底部，将处于对数生长期的M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞接种于Transwell小室上室，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。取出Transwell小室，擦除滤膜上层基质胶，95%乙醇固定30 min，常规HE染色。光镜拍照，统计穿膜细胞数，以M2(pcDNA3.1)细胞的穿膜细胞数为1，计算各组细胞的穿膜细胞相对值，统计分析结果。此实验重复3次。

1.2.6Western blot检测蛋白表达水平：培养M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞，终浓度为20 nmol/L EGF无血清培养基分别培养0、5、10、30 min。提取各组总蛋白，煮沸变性。将蛋白样品等体积上样，在8%分离胶及5%浓缩胶中进行电泳，在转膜缓冲液中将胶上的蛋白转印到PVDF膜上。孵育抗体，分别检测M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞中EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK、Cav-1和β-actin的蛋白表达水平，测量灰度值，分别计算各组细胞p-EGFR、p-Akt和p-ERK占总EGFR、Akt和ERK的相对值，统计结果并分析。此实验重复3次。

2 结果

2.1稳定转染细胞株中Cav-1蛋白的表达水平 M2、M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞中Cav-1表达量的相对灰度值分别是1.00、0.83±0.08和2.01±0.21。与M2和M2(pcDNA3.1)相比，M2(Cav-1)质粒转染组细胞Cav-1蛋白表达明显增高(P<0.01)。见图1。

图1 过表达Cav-1 M2细胞系的构建

2.2过表达Cav-1对M2细胞增殖的影响 在终浓度分别为0、4、20、100 nmol/L EGF刺激下，M2(pcDNA3.1)细胞增殖能力分别为0.92±0.03、1.03±0.11、1.10±0.10、1.22±0.09，M2(Cav-1)细胞增殖能力分别为0.63±0.05、0.73±0.06、0.80±0.02、0.89±0.03。M2(Cav-1)细胞增殖能力低于M2(pcDNA3.1)细胞(P<0.01)。

2.3过表达Cav-1对M2细胞迁移的影响 在无EGF刺激条件下，5、10、15 h均可见M2(Cav-1)细胞划痕愈合速度较慢，其划痕愈合的相对宽度值分别为0.92±0.03、0.81±0.05、0.65±0.01，M2(pcDNA3.1)细胞划痕愈合的相对宽度值分别为0.72±0.02、0.57±0.03、0.34±0.04。M2(Cav-1)细胞划痕愈合的相对宽度值大于M2(pcDNA3.1)细胞(P<0.01)。当存在EGF刺激条件下，M2(Cav-1)细胞在5、10、15 h划痕愈合速度同样慢于M2(pcDNA3.1)细胞，M2(Cav-1)细胞划痕相对宽度分别为0.82±0.03、0.73±0.02、0.46±0.03，M2(pcDNA3.1)细胞分别为0.63±0.03、0.42±0.02、0。M2(Cav-1)细胞划痕相对宽度大于M2(pcDNA3.1)细胞(P<0.01)。见图2。

2.4过表达Cav-1对M2细胞侵袭的影响 M2(pcDNA3.1)细胞穿过Transwell小室滤膜的细胞相对值为1.00，M2(Cav-1)细胞为0.59±0.08。与M2(pcDNA3.1)细胞相比，M2(Cav-1)细胞侵袭能力减弱(P<0.01)。见图3。

图2 不同时点Cav-1对M2细胞迁移能力的影响(×100)

2.5过表达Cav-1 在M2细胞中对配体诱导的EGFR信号通路的影响 选取M2(pcDNA3.1)细胞和M2(Cav-1)细胞，采用Western blot检测EGF刺激5、10、30 min后p-EGFR、p-Akt以及p-ERK水平。分别提取M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞总蛋白，用Cav-1抗体检测证实M2(Cav-1)细胞中Cav-1表达量明显升高，为进一步分析Cav-1在EGFR信号通路中的作用提供依据。分别用抗磷酸化EGFR、Akt及ERK抗体检测M2(pcDNA3.1)和M2(Cav-1)细胞总蛋白。见图4。在有EGF刺激的条件下，M2(Cav-1)细胞5、10、30 min磷酸化EGFR、Akt和ERK相对值均明显低于M2(pcDNA3.1)细胞(P<0.01)。见表1。

图3Cav-1对M2细胞侵袭能力的影响(HE×200)

3 讨论

Cav-1作为一种多功能跨膜支架蛋白，存在于多种细胞类型中，参与细胞吞饮、胆固醇转运、细胞膜组装、信号跨膜转导等细胞生命活动[6-7]。其中，Cav-1涉及细胞恶性转化等方面的生物学行为，一直备受关注[8-10]。目前已有研究表明，肿瘤的增殖与迁移可由细胞内Cav-1表达量的下降引起。同时，Cav-1的缺失有可能影响其作为抑癌因子发挥作用时调控的信号通路[11]。在多种肿瘤中，如乳腺癌[12]、子宫颈癌[13]、胃癌[14-15]等均可发现，Cav-1表达量较正常组织明显下调，被认为有抑制肿瘤发展和转移的作用，是一种潜在抑癌基因。但在有关前列腺癌的研究中却发现，Cav-1可以促进细胞的增殖、侵袭与转移[16-17]。由此可见，Cav-1在不同组织肿瘤中的表达存在较大的差异，既可促进肿瘤的生长，又可抑制其发生、发展。然而，有关Cav-1在恶性黑色素瘤中的具体作用尚未得到明确阐述。

Cav-1基因位于D7S522和D7S2460的中间，定位于7q31.1。在许多人类恶性肿瘤中，Cav-1基因经常在7号染色体的这个位点发生突变或缺失。国内大量研究认为CSD介导了Cav-1的肿瘤抑制作用，而Cav-1的促进肿瘤发生作用可能与生长因子诱导Cav-1的酪氨酸和丝氨酸磷酸化以及胆固醇结合到Cav-1基因启动子上引起的Cav-1表达上调有关。本实验通过质粒转染技术建立了过表达Cav-1的恶性黑色素瘤M2细胞株，并进行了MTS、划痕愈合、Transwell等试验，结果显示过表达Cav-1可使细胞增殖、迁移、侵袭能力下降。

图4恶性黑色素瘤细胞中过表达Cav-1对磷酸化EGFR、Akt、ERK活化水平的影响

表1 恶性黑色素瘤细胞中过表达Cav-1对磷酸化EGFR、Akt、ERK表达水平的影响

注：与对照组比较，bP<0.01

有研究证明，肿瘤细胞侵袭转移的各个阶段均与肿瘤细胞的跨膜机制密切相关，特别是通过影响EGFR及其下游的信号传递发挥调控作用。EGFR是细胞膜表面的糖蛋白受体，属于ErbB受体家族，是酪氨酸受体家族的成员之一，有配体结合区、跨膜区和胞内区3个部分。胞内区的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosinekinase， RTK)系统是其发挥作用的主要部位[18]。EGFR在未激活时是以单体形式存在的，而当其与配体结合后，即可形成同源、异源二聚体，从而激活RTK，提高了受体胞内区酪氨酸残基的自身磷酸化水平，进一步激活下游信号通路。其下游信号主要包括MAPK/ERK、PI3K/AKT、STAT3等通路。其中，MAPK/ERK、PI3K/Akt信号转导通路是细胞内两条重要的存活及抗凋亡信号通路。Zhang等[19]研究认为，EGFR的表达与恶性黑色素瘤的发生、发展密切相关。本研究发现过表达Cav-1可使恶性黑色素瘤M2细胞中的p-EGFR、p-ERK以及p-Akt蛋白水平明显下降。提示Cav-1可能通过抑制MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路发挥作用。

综上所述，本实验通过分析Cav-1与EGFR及其信号通路分子之间的关系，进一步阐明了Cav-1在恶性黑色素瘤中的作用机制。实验结果显示Cav-1可能通过抑制MAPK/ERK、PI3K/Akt信号通路影响恶性黑色素瘤细胞M2的生物学行为。说明Cav-1可能成为恶性黑色素瘤治疗的潜在靶点，而其具体机制有待于进一步研究。

[参考文献]

[1] Oliveira-Cunha M， Hadfield K D， Siriwardena A K，etal. EGFR and KRAS mutational analysis and their correlation to survival in pancreatic and periampullary cancer[J].Pancreas, 2012,41(3):428-434.

[2] Hwangbo W ，Lee J H， Ahn S，etal. EGFR gene amplification and protein expression in invasive ductal carcinoma of the breast[J].Korean J Pathol, 2013,47(2):107-115．

[3] Kalman B， Szep E， Garzuly F，etal. Epidermal growth factor receptor as a therapeutic target in glioblastoma[J].Neuromolecular Med, 2013,15(2):420-434．

[4] Shan Z Z, Chen P N, Wang F，etal. Expression of p-EGFR and p-Akt protein in esophageal squamous cell carcinoma and its prognosis[J].Oncol Lett， 2017，14(3):2859-2863.

[5] 袁渊，罗婷婷，姚启盛，等．沉默Caveolin-1基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响[J].医学临床研究，2014,31(12)：2358-2360.

[6] Yang H， Guan L， Li S，etal. Mechanosensitive caveolin-1 activation-induced PI3K/Akt/mTOR signaling pathway promotes breast cancer motility, invadopodia formation and metastasis in vivo[J].Oncotarget， 2016，7(13):16227-16247.

[7] Sowa G. Caveolae, Caveolins, Cavins, and Endothelial Cell Function: New Insights[J].Front Physiol， 2012,6(2):120．

[8] Wang S, Wang N, Zheng Y,etal. Caveolin-1: An Oxidative Stress-Related Target for Cancer Prevention[J].Oxid Med Cell Longev， 2017，2017:7454031.

[9] Nwosu Z C, Ebert M P, Dooley S,etal. Caveolin-1 in the regulation of cell metabolism: a cancer perspective[J].Mol Cancer， 2016，15(1):71.

[10] Mahmood J, Zaveri S R, Murti S C,etal. Caveolin-1: a novel prognostic biomarker of radioresistance in cancer[J].Int J Radiat Biol， 2016，92(12):747-753.

[11] Quest A F, Lobos-González L, Nuez S,etal. The Caveolin-1 connection to cell death and survival[J].Curr Mol Med， 2013，13(2):266-281.

[12] 王善伟，徐侃伦，赵莉莉，等.Caveolin-1在乳腺浸润性导管癌间质内癌相关成纤维细胞中的表达水平与乳腺癌分子亚型的相关性[J].临床肿瘤学杂志,2012,17(6):511-515.

[13] Sun J, Gao J, Hu J B,etal. Expression of Cav-1 in tumour cells, rather than in stromal tissue, may promote cervicalsquamous cell carcinoma proliferation, and correlates with high-risk HPV infection[J].Oncol Rep， 2012，27(6):1733-1740.

[14] Zhang Y, Hu X J, Zhang L L,etal. Interaction among Caveolin-1 genotypes (rs3807987/rs7804372), H. pylori infection, and risk of gastric cancer in a Chinese population[J].Tumour Biol, 2014,35(2):1511-1516.

[15] Zhao X, He Y, Gao J,etal. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer[J].PLoS One， 2013，8(3):e59102.

[16] Ayala G, Morello M, Frolov A,etal. Loss of caveolin-1 in prostate cancer stroma correlates with reduced relapse-free survival and is functionally relevant to tumour progression[J].J Pathol， 2013，231(1):77-87.

[17] Kuo S R, Tahir S A, Park S,etal. Anti-caveolin-1 antibodies as anti-prostate cancer therapeutics[J].Hybridoma (Larchmt)， 2012，31(2):77-86.

[18] 唐夏莉，焦德敏，陈君，等.miRNA-126对肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭及EGFR/AKT/mTOR信号通路的影响[J].中国病理生理杂志，2016，32(3):458-463.

[19] Zhang K, Zhu T, Gao D,etal. Filamin A expression correlates with proliferation and invasive properties of human metastaticmelanoma tumors: implications for survival in patients[J].J Cancer Res Clin Oncol， 2014，140(11):1913-1926.